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.2001年9月；21(17):5826-37.
doi:10.1128/MCB.21.17.5826-5837.2001。

人热休克因子1转录激活域招募人SWI/SNF

E K沙利文 1, C S魏里奇, J R盖恩, S Sif公司, R E金斯顿
附属公司

人热休克因子1转录激活域招募人SWI/SNF

E K沙利文等。 摩尔细胞生物学. 2001年9月.

摘要

SWI/SNF等染色质重塑复合物利用ATP水解的能量重塑核小体DNA并增加核小体模板的转录。人类热休克因子1（hHSF1）是一种严格调控的激活物，利用其激活域的不同部分刺激转录起始和延伸。在这里，我们证明hHSF1与BRG1相关，BRG1是在内源性蛋白质浓度下人类SWI/SNF的ATP酶亚单位。我们还发现，hHSF1激活域将hSWI/SNF招募到纯化系统中的染色质模板。负责激活转录延伸的hHSF1残基的突变对SWI/SNF的募集以及hHSF1与BRG1的关联具有最严重的影响，表明染色质重塑活性的募集可能在刺激延伸中起作用。

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数字

图1
图1
稳定HSF1-flag细胞系的建立。（A） HSF1构造的示意图。DBD，DNA结合域；TD，三聚结构域；RD，监管领域；AD1，激活域I；AD2，激活域II。（B） HSF1-FLAG细胞系与亲本HeLa细胞系中总hHSF1（HSF1-FLAG加内源性HSF1）、细胞核（nuc）和细胞质（cyto）的表达水平，通过使用抗HSF1抗体（α-HSF1）（应激原）的Western blot分析获得。
图2
图2
人HSF1与人BRG1和染色质重塑活性的关系。（A） 全长HSF1-FLAG的M2（抗FLAG）纯化部分通过SDS-PAGE进行解析，并使用抗BRG1抗体（顶面板）和抗FLAG抗体D-8多克隆（Santa Cruz）（中面板）通过银染色（底面板）或Western blot分析进行分析。BRG1流程与输入相当。比较表达HSF1-FLAG的细胞系（第2道）和HeLa细胞系对照（第3道）的热休克分数。（B） 在DNase I单核小体破坏分析中，将来自面板A的相同组分（第5至8道）与纯化的hSWI/SNF（第3和4道）进行比较。裸DNA被DNase I消化作为对照（通道1和2）。打开的椭圆表示ATP依赖性强度增加的带，而关闭的椭圆表示ATP依赖性强度降低的带。车道1和2的曝光较浅，以便更好地看到高度消化的车道中的带状物。（C） 通过SDS-PAGE解析来自INI1-FLAG（hSWI/SNF亚基）的M2（抗FLAG）纯化的级分，并通过使用抗BRG1抗体（上图）、抗HSF1抗体（亲和生物试剂）（中间图）和抗FLAG抗体（M5，Sigma）（下图）的蛋白质印迹分析进行分析。抗HSF1实验需要更长的曝光时间，以便更好地观察HSF带。（D） 用SDS-PAGE对INI1-标记物（1区）和HeLa细胞系对照（2区）的M2（抗FLAG）纯化物进行解析，并用抗HSF1抗体（Stressgen）进行Western blot分析。
图3
图3
发现人类HSF1激活域突变体与人类BRG1和染色质重塑活性存在差异。（A） GAL4-HSF标记融合物M2（抗FLAG）纯化的部分通过SDS-PAGE进行解析，并使用抗BRG1抗体（顶部面板）和抗FLAG抗体（M5；Sigma）（中间面板）通过银染色（底部面板）或Western blot分析进行分析。比较来自表达GAL4-HSF野生型（泳道1）、GAL4-HSF酸性突变体（泳道2）、GAL4-HSF苯丙氨酸突变体（泳道3）和HeLa细胞系对照（泳道4）的细胞系的热休克组分。（B） 在DNase I单核小体破坏分析中，将面板A中显示的相同组分（第5至12道）与纯化的hSWI/SNF（第3和4道）进行比较。用DNase I（通道1和通道2）消化裸DNA作为对照。打开的椭圆表示ATP依赖性强度增加的带，而关闭的椭圆表示ATP依赖性强度降低的带。车道1至4的曝光较浅，以便更好地看到高度消化的车道中的带状物。
图4
图4
基于BRG1的SWI/SNF复合体似乎负责HSF1相关的重塑活动。（A） 在超螺旋分析中，比较了HeLa细胞系对照（1区）和GAL4-HSF野生型（2区）M2（抗FLAG）纯化后的核组分，二者均加上ATP。五十、 线性DNA；Sc，完全超螺旋DNA。（B） 通过SDS-PAGE解析来自GAL4-HSF酸性突变体、GAL4-HSF苯丙氨酸突变体和HeLa细胞系对照的M2（抗FLAG）纯化的核级分，并通过使用抗BRG1抗体（上图）和抗FLAG抗体（M5；西格玛）（中间图）的Western印迹分析进行测定。然后在超螺旋分析中将这些组分（通道3至8）与纯化的hSWI/SNF（通道1和通道2）进行比较。五十、 线性DNA；Sc，完全超螺旋DNA。（C） 将GAL4-HSF野生型、GAL4-HSE酸性突变体和GAL4-HSS苯丙氨酸突变体M2（抗FLAG）纯化的核组分与核提取物输入进行比较。样品通过SDS-PAGE进行解析，并使用抗hBRM抗体进行Western blot分析。
图5
图5
HSF1野生型激活域能够将SWI/SNF靶向染色质模板。显示了限制性内切酶可及性分析的结果。（A） 限制性内切酶可及性分析中使用的5S阵列核糖体模板图。两个中央核小体没有定位。最小腺病毒E4启动子上游有五个Gal4 DNA结合位点。Xba公司我，海三、 和哈哈I是存在于非定位中心区域的三个限制性内切酶裂解位点。（B） 实验40分钟时间点的原始数据，其结果显示在面板C中。（C）图显示了Xba公司我切割5S阵列。所有反应均包含1 nM模板核小体和0.3 UXba公司I/μl，在整个反应过程中都存在。S/S，2 nM人SWI/SNF复合物；PN，240 nM多核小体作为竞争对手；G4-HSF-wt，2 nM GAL4-HSF野生型，细菌纯化蛋白。速率常数（分钟−1)：平均，−ATP，7.6×10−3; S/S，+ATP，81.5×10−3; S/S，+PN，+ATP，22.3×10−3; S/S，+PN，+G4-HSF-wt，+ATP，53.7×10−3.（D）实验40分钟时间点的原始数据，其结果显示在面板E中。（E）图显示了Xba公司我切割5S阵列。所有反应均包含1 nM浓度的模板核小体和0.9 U的Xba公司I/μl，在整个反应过程中都存在。S/S，5 nM人SWI/SNF复合物；PN，200 nM多核小体作为竞争对手；G4-DBD，5 nM GAL4-DNA结合域（1至94）。G4-HSF-wt，5 nM GAL4-HSF野生型。所有GAL4-HSF蛋白均经细菌纯化。速率常数（分钟−1)：S/S，+ATP，45.4×10−3; S/S、+PN、−ATP、5.8×10−3; S/S，+PN，+ATP，11.2×10−3; S/S、+PN、+G4-DBD、+ATP、12.5×10−3; S/S，+PN，+G4-HSF-wt，+ATP，24.9×10−3.
图6
图6
GAL4-HSF激活域突变体以差异方式靶向hSWI/SNF。显示了限制性内切酶可及性分析结果。（A） 面板B中描述的实验40分钟时间点的原始数据。（B）该图显示了Xba公司我切割5S阵列。所有反应均包含1 nM浓度的模板核小体和0.6 U的Xba公司I/μl，在整个反应过程中都存在。S/S，5 nM人SWI/SNF复合物；PN，200 nM多核小体作为竞争对手；G4-DBD，5 nM GAL4-DNA结合域（1到94）；G4-HSF-wt，5 nM GAL4-HSF野生型。G4-HSF-ac，5 nM GAL4-HSF酸性突变体；G4 HSF phe，5nM GAL4-HSF苯丙氨酸突变体。所有GAL4蛋白均经细菌纯化。速率常数（分钟−1)：S/S，+ATP，76.1×10−3; S/S，+PN，+ATP，14.0×10−3; S/S，+PN，+G4-HSF-wt，+ATP，54.0×10−3; S/S、+PN、+G4-HSF-ac、+ATP、28.8×10−3; S/S，+PN，+G4 HSF ph，+ATP，13.2×10−3（C）柱状图，总结了Xba公司我切入了四个不同的实验（包括面板B中描述的实验）。所有反应均包含1 nM模板核小体和0.6至0.9 UXba公司I/μl，在整个反应过程中都存在。S/S，5 nM人SWI/SNF复合物；PN，200至600 nM多核小体作为竞争对手；G4-DBD，5 nM GAL4-DNA结合域（1到94）；G4-HSF-wt，5 nM GAL4-HSF野生型；G4-HSF-ac，5 nM GAL4-HSF-酸性突变体；G4-HSF-phe，5 nM GAL4-HSF苯丙氨酸突变体。每个条形图表示标准误差。
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