Differential effects of p19(Arf) and p16(Ink4a) loss on senescence of murine bone marrow-derived preB cells and macrophages

doi:10.1073/pnas.171217498

.2001年8月14日；98(17):9654-9.

doi:10.1073/pnas.171217498。 Epub 2001年7月31日。

p19（Arf）和p16（Ink4a）缺失对小鼠骨髓源性前B细胞和巨噬细胞衰老的差异影响

D H Randle公司¹, F津迪, C J谢尔, M F Roussel先生

附属公司

PMID： 11481442
预防性维修识别码： PMC55507
内政部： 10.1073/pnas.171217498

p19（Arf）和p16（Ink4a）缺失对小鼠骨髓源性前B细胞和巨噬细胞衰老的差异影响

D H Randle公司等。美国国家科学院程序. 2001.

.2001年8月14日；98(17):9654-9.

doi:10.1073/pnas.171217498。 Epub 2001年7月31日。

作者

D H兰德尔¹, F津迪, C J谢尔, M F Roussel先生

附属

¹美国田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院肿瘤细胞生物学系和霍华德·休斯医学研究所，邮编38105。

PMID： 11481442
预防性维修识别码： PMC55507
内政部： 10.1073/pnas.171217498

摘要

从原代小鼠胚胎成纤维细胞建立细胞系取决于Arf肿瘤抑制因子或其下游靶点p53转录因子的缺失。小鼠p19（Arf）由Ink4a-Arf基因座编码，该基因座还指定了第二个肿瘤抑制蛋白，即细胞周期蛋白D依赖性激酶抑制剂p16（Ink4a）。我们调查了来自野生型、Ink4a-Arf-null或Arf-nul小鼠的骨髓源细胞在连续传代培养过程中绕过衰老的能力。与野生型小鼠的前B细胞不同，那些来自缺乏Arf的小鼠的细胞，如果放在用于产生IL-7的基质饲养层上，可以无限期繁殖。前B细胞系保持二倍体和IL-7依赖性，并继续表达升高的p16（Ink4a）水平。相比之下，依赖集落刺激因子-1进行增殖和存活的Arf-null骨髓源巨噬细胞最初生长速度较慢，但产生了快速持续生长但仍依赖生长因子的变体，这些变体停止表达p16（Ink4a）。野生型骨髓源巨噬细胞最初同时表达p16（Ink4a）和p19（Arf），但当p16（Insk4A）表达被抑制时，其寿命延长。在所有情况下，基因沉默都伴随着Ink4a启动子的甲基化。因此，虽然Arf丢失本身似乎是在培养中建立小鼠成纤维细胞和前B细胞系的主要决定因素，但p16（Ink4a）为骨髓源性巨噬细胞的永生化提供了有效屏障。

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数字

图1
第19页^阿尔夫缺乏绕过前B细胞的衰老。(A类)测定了五种细胞的生长动力学独立导出的线*阿尔夫*-空（■）在含有IL-7的培养基和与之前由*BCR-Abl公司*(⧫). (B)暴露于4 Gy后γ射线照射，指示基因型的前B细胞(底部)培养24h并用膜联蛋白V和碘化丙啶测定细胞活力。(C)在表达IL-7的饲养器上维持前B细胞以10天的间隔（天，底部)为期2个月。结果与BCR-Abl转化细胞获得的细胞（p210）。蛋白质用抗体直接免疫印迹法检测第19页^阿尔夫和第16页^墨水4a，如左图所示保证金。α-微管蛋白检测用于确认相等的蛋白质加载。

图2
巨噬细胞的增殖动力学和蛋白质表达不同基因型。(A类)培养的骨髓源性巨噬细胞在60毫米直径的培养皿中，当汇合和再稀释1:5时进行计数用于下一段。绘制了六种独立培养物的数据派生自*阿尔夫*-空（■），*墨水4a-Arf*-空（⧫）和野生型（▴）小鼠，并与已建立的巨噬细胞进行比较线路，BAC1.2F5（●）(B)单元格在指定时间服用，检测第16页^墨水4a免疫印迹法检测α-微管蛋白。巨噬细胞对指定时间（天）的生长进行直接分析p19的免疫印迹^阿尔夫(C)或通过p15的顺序免疫沉淀和印迹^墨水4b(D类). (E类)显示的巨噬细胞基因型(顶部)连续不同时间后文化(底部)受到5 Gyγ射线照射（+）或未经处理（−），并通过免疫印迹分析p53和Mdm2蛋白诱导。具有多个代表性的结果独立衍生的种群如所示*C–E类*.

图3
转录抑制*墨水4a*已建立骨髓源性巨噬细胞。(A类)巨噬细胞的裂解物在连续培养的不同时间后进行免疫印迹第16页^墨水4aα-微管蛋白；三个独立的克隆野生型和*阿尔夫*-对空白细胞进行了研究。(B)用RNA进行Northern blot分析从中描述的相同细胞的平行培养物中提取A类RNA与外显子1α探针特异性杂交对于*墨水4a*; 18S rRNA水平由亚甲基测定蓝色染色。

图4
转录沉默和甲基化*墨水4a*在里面晚期传代巨噬细胞。(A类)外显子1α示意图5′近端启动子区指示感觉的位置用于扩增201-bp的（1→）和反义（←2）寡核苷酸BM-derived基因组DNA亚硫酸氢盐修饰后的产物巨噬细胞。(B)未修饰基因组DNA的PCR分析从不同时间（培养天数）采集的巨噬细胞中含有已知p16细胞的DNA^墨水4a状态（MEF克隆10阳性对照；BAC1.2F5，阴性对照）野生型基因序列。(C)PCR分析亚硫酸氢盐修饰的DNA来自B通过使用寡核苷酸区分非甲基化（U）和甲基化（M）序列。缺乏PCR反应模板（H₂O）用作阴性对照。几个比较每个基因型的独立衍生群体。

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