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.2001年7月15日；15(14):1771-82.
doi:10.10101/gad.892401。

信使RNA被招募用于转录期间的核输出

E P雷 1, H克雷伯, P A银
附属公司

信使RNA被招募用于转录期间的核输出

E P雷等。 基因开发. .

摘要

在转录和处理之后，真核mRNA从细胞核输出到细胞质进行翻译。在这里，我们提供证据表明，mRNAs是核出口共转录的靶点。酿酒酵母hnRNP Npl3和TATA-结合蛋白（TBP）的联合突变阻断了mRNA的输出，这意味着Npl3的共转录募集是mRNA有效输出所必需的。此外，Npl3可以在与RNA Pol II的复合物中发现，这表明Npl3与转录机制有关。最后，根据染色质免疫沉淀测定，Npl3以转录依赖的方式被招募到基因中。另一个mRNA输出因子Yra1也与染色质共转录相关，但似乎在以后的步骤中被招募。综上所述，我们的结果表明，输出因子被招募到转录位点以促进有效的mRNA输出。

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数字

图1
图1
spt15-ts1 npl3-27Npl3-27输出使细胞变慢，并显示合成mRNA输出缺陷。(A类)野生型Npl3或Npl3-27的定位（PSY580，a–c),npl3-27号机组（PSY1031，d–f日),spt15-ts1编号：npl3-27（PSY1698，g–i)和spt15-ts1电池（PSY1702，j–l). 将细胞移到37°C下1h。用Npl3多克隆抗体进行间接免疫荧光(左边)、DAPI(中心)和Nomarski图像(正确的)如图所示。(B类)聚（A）的局部化+野生型RNA(a–c),npl3-27号机组(d–f日),spt15-ts1 npl3-27(g–i类)、和spt15-ts1单元格(j–l). 将细胞移到37°C下1小时，用寡核苷酸（dT）进行原位杂交50探针(左边)、DAPI(中心)和Nomarski图像(正确的)如图所示。
图1
图1
spt15-ts1 npl3-27Npl3-27输出使细胞变慢，并显示合成mRNA输出缺陷。(A类)野生型Npl3或Npl3-27的定位（PSY580，a–c),npl3-27号机组（PSY1031，d–f日),spt15-ts1 npl3-27（PSY1698，g–i类)和spt15-ts1电池（PSY1702，j–l). 将细胞移到37°C下1h。用Npl3多克隆抗体进行间接免疫荧光(左边)、DAPI(中心)、和Nomarski图像(正确的)如图所示。(B类)poly（A）的本地化+野生型RNA(a–c),npl3-27号机组(d–f日),spt15-ts1编号：npl3-27(g–i类)、和spt15-ts1单元格(j–l). 将细胞移到37°C下1小时，用寡核苷酸（dT）进行原位杂交50探针(左边)、DAPI(中心)和Nomarski图像(正确的)如图所示。
图2
图2
npl3-27号机组对总mRNA水平没有影响。(A类)全聚（A）的缝隙杂交+野生型RNA（车道1–2PSY580和603），spt15-ts1 npl3-27（车道3–4，PSY1698和1699），spt15-ts1（车道5–6PSY1702和1703），以及npl3-27号机组单元格（车道7–8PSY1031和1032）。细胞在25°C下生长至对数期，分离培养物，一半转移至37°C 1 h，并分离总RNA。用探针探测2μg总RNA32P标记的poly-dT探针。(B类)行动1野生型北部（车道1–2),spt15-ts1编号：npl3-27（车道3–4),spt15-ts1（车道5–6)、和npl3-27号机组单元格（车道7–8). 细胞在25°C下生长至对数期，分离培养物，一半转移至37°C 1 h，并分离总RNA。琼脂糖凝胶电泳分离的15μg总RNA用32P-标记行动1探查。
图3
图3
Npl3和RNA Pol II形成一个不依赖RNA的复合物。来自细胞裂解物的Npl3用α-Npl3抗体免疫沉淀(底部). 一级抗体的重链用星号表示。RNA Pol II与Npl3共免疫沉淀(顶部). 总细胞裂解物已加载（车道1). 在结合和洗涤后，样品在洗涤缓冲液（lane）中用50μg/mL RNase A处理三)或单独清洗缓冲区（车道2)并在RT下孵育20分钟。样品清洗一次，并在样品加载缓冲液中培养，在7%SDS-PAGE凝胶上运行，并用抗Pol II CTD的α-Npl3抗体或8WG16进行蛋白质印迹。没有主要样本是缺乏主要抗体的模拟IP（lane4). 所示斑点来自同一实验中的两种不同凝胶。约20%的Npl3和0.02%的Pol II从裂解液中免疫沉淀。
图4
图4
Npl3与组成性表达的Pol II转录的启动子和编码序列交联项目管理A1基因。(A类)的示意图项目管理A1引物组1跨越启动子，包括TATA盒。引物集2跨越编码序列的5′区域。引物集3跨越编码序列的3′区域。（ATG=+1）。引物集4跨越一个非转录的基因间区域。(B类)Npl3免疫沉淀物启动子及其编码序列项目管理A1.输入的定量PCR(左边)，α-TBP免疫沉淀(中心)和α-Npl3免疫沉淀(正确的)使用引物组1-4个跨越区域，如中所示A类PCR产物在8%TBE聚丙烯酰胺凝胶上分离。显示了每个模板的单一稀释度，并且在PCR的线性范围内（未显示数据）。(C类)α-Npl3免疫沉淀物质的定量。原始值以图形形式表示为输入的百分比。单个实验显示的误差条>0.1。通过将每个引物组获得的百分比除以引物4获得的百分比，得出标准值(底部). (D类)Npl3与Pol III转录基因无关。输入的定量PCR（车道1–3)和Npl3免疫沉淀物（车道4–6)跨越tRNA的DNA通用电气公司基因（车道1,4)，tRNACUU公司基因（车道2,5)和基因间区域（车道3,6).
图5
图5
Npl3交联到启动子和编码序列镀锌10以转录依赖的方式。(A类)的示意图镀锌10.底漆组1跨越上游激活序列。引物集2跨越启动子和5′编码序列。引物集3跨越编码序列的中间。引物集4跨越3′编码序列。引物集5跨越一个非转录的基因间区域。(B类)Npl3免疫沉淀物启动子及其编码序列镀锌10在诱导条件下。输入的定量PCR(左边)，α-TBP免疫沉淀(中心)和α-Npl3免疫沉淀(正确的)使用引物集1–5个跨越区域，如A类.细胞在葡萄糖中生长(顶部)或半乳糖(底部). (C类)α-Npl3免疫沉淀物质的定量。在葡萄糖（白色）和半乳糖（灰色）中生长的细胞的原始值以图形形式表示为输入的百分比。一个实验的误差条>0.3。通过将每个引物组的半乳糖值除以葡萄糖值，并将其归一化为引物组5，得到归一化比率值。
图6
图6
Yra1以转录依赖的方式与基因的3′端相关。(A类)Yra1-myc与项目管理A1促进剂（bar1)，5′编码序列（bar2)，和3′编码序列（bar三)和基因间区（bar4). 显示了归一化到基因间区域的值(底部). (B类)Yra1-myc与镀锌10UAS（巴1)，5′编码序列（条2)，中间编码序列（条三)，3′编码序列（条4)和基因间区（bar5)在棉子糖（白色）和半乳糖（灰色）中生长的细胞中。显示标准化比率值(底部).
图7
图7
mRNA输出因子共转录招募模型。Npl3可能被启动前复合体中的Pol II招募到转录机制和/或延长Pol II，然后转移到新生转录物。随着伸长率的增加，Npl3的进一步补充仍在继续。CBC也被招募到可能依赖Npl3的新生转录物中。Yra1在转录的后期与新生RNA结合。其他RNA-结合蛋白显示为黑色。这些因素的共同征募促进了RNP的有效出口。
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