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.2001年5月14日；153(4):865-80.
doi:10.1083/jcb.153.4.865。

果蝇内着丝粒蛋白（INCENP）和极光B在组蛋白H3磷酸化、中期染色体比对、动粒分离和染色体分离中的重要作用

R R亚当斯 1, H马亚托, W C恩肖, M卡梅娜
附属公司

果蝇内着丝粒蛋白（INCENP）和极光B在组蛋白H3磷酸化、中期染色体比对、动粒分离和染色体分离中的重要作用

R R亚当斯等人。 J细胞生物学. .

摘要

我们对两种染色体乘客蛋白，内着丝粒蛋白（INCENP）和极光B激酶在黑腹果蝇培养细胞中的作用进行了生化和双链RNA介导的干扰（RNAi）分析。INCENP和极光B功能紧密相连。这两种蛋白在体外相互结合，DmINCENP是DmAurora B在有丝分裂中正确定位并发挥组蛋白H3激酶功能所必需的。DmAurora B是在着丝粒积累DmINCENP并在后期转移到纺锤体所必需的。任何一种蛋白质的RNAi都会显著抑制细胞实现正常中期染色体比对的能力。然而，细胞在有丝分裂过程中没有受阻，进入异常后期，其特征是姐妹动粒分离缺陷和大量无定形滞后染色质的存在。后期A染色体运动似乎正常，但胞质分裂经常失败。驱动蛋白样蛋白Pavarotti（ZEN-4/CHO1/MKLP1）在末期正确定位到中体不需要DmINCENP和DmAurora B。这些实验揭示了极光B激酶功能需要INCENP，并证实了染色体乘客在有丝分裂中具有重要作用。

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数字

图1
图1
地图DmINCENP公司本研究中使用的位点和结构。DmINCENP公司（CG12165）位于P1克隆AA005425上，包含六个外显子。编码溴代主要蛋白（CG1845）的基因转录方向与DmINCENP公司基因；ORF由～700个核苷酸分开。燃烧NH2-表达COOH末端结构以制备免疫抗原，表达全长INCENP用于微管结合和DmAurora B结合实验。（序列数据可从GenBank/EMBL/DDBJ获得，注册号如下。）
图2
图2
（A） 用GST-INCENP抗体R801检测苍蝇胚胎总蛋白提取物的免疫印迹1–348.可以看到110 kD的单个频带。（B–Q）DmINCENP在胚胎和培养细胞中的定位。用R801（红色）、α-微管蛋白（绿色）和DNA（蓝色）对所有面板进行INCENP染色。（B） 合胞前期（注意DmINCENP分布于凝聚染色体的臂部和着丝粒）；（F） 合胞中期和早期后期；（J） 合胞体后期。（C、G和K）分别从B、F和J中选择的有丝分裂像的放大。（D、H和L）相应的INCENP染色；（E、I和M）相应的DNA染色。箭头显示H和I的着丝粒染色，以及K（N）细胞化胚胎有丝分裂域的中区染色，显示细胞处于有丝分裂的不同阶段。m、 中期；a、 后期；t、 末期。（O–Q）Dmel2细胞分别处于中期、后期和末期。棒材，5μm。
图3
图3
（A–L）DmAurora B在胚胎和培养细胞中的免疫定位。DNA（蓝色）、DmAurora B（红色）和微管蛋白（绿色）如图所示。（A） 合胞核进入有丝分裂。黑色箭头表示核（在C中放大）正好位于有丝分裂波之前，缺乏可检测的极光B染色。白色箭头指向进入前期的细胞核（在图D中放大），DmAurora B积聚在着丝粒处。（E–H）DmAurora B在不同有丝分裂阶段的合胞核定位。注意DmAurora B从前期到中期仅位于着丝粒。DmAurora B在后期重新分布到纺锤体中区。（B） 细胞化周期14胚胎的有丝分裂域显示DmAurora B处于前中期（pm）、中期（m）、晚期（a）和末期（t）。（I–K）Dmel2染色分别在中期、后期和末期。白色箭头指向着丝粒（I）和中体（K）染色。（L） Aurora B的免疫染色通过与重组Aurora B蛋白共孵育来阻止（黑色箭头显示没有染色）。棒材，5μm。
图4
图4
（A） DmINCENP直接与微管结合。（车道M）分子量标记。（1-5道）微管颗粒经蔗糖垫沉淀后的考马斯蓝染色凝胶。64%添加的INCENP（第4道），但没有GST（第5道）与微管结合。INCENP在没有微管的情况下不会沉淀，但会留在上清液中（通道2和7）。（通道6–10）上清液部分的考马斯蓝染色凝胶。36%的INCENP，但所有GST，都与微管（9和10道）无关。（B） DmINCENP在体外与DmAurora B结合。考马斯蓝染色凝胶，显示DmAurora B输入（通道1，5%负载）。（通道2–3）GST-结合珠与缓冲液（通道2）或DmAurora B（通道3，50%负载）孵育。没有DmAurora B与GST珠相关。（4–5道）GST-INCENP-结合珠与缓冲液（4道）或DmAurora B（5道，50%装载）一起培养。19%的新增DmAurora B与GST-INCENP合作。
图5
图5
RNAi对细胞生长和有丝分裂的影响概述。（A′和A〃）通过免疫染色（INCENP和aurora B RNAi）和免疫印迹（仅INCENP-RNAi）评估RNAi的疗效。图表显示了缺乏可检测INCENP或极光B染色的细胞百分比(n个= 75). 部分耗尽的细胞未被评分为空。在NIH图像中对INCENP免疫印迹进行定量，并根据微管蛋白负荷控制进行标准化，水平表示为t吨=0级。（B） 对照细胞和dsRNA处理细胞的生长曲线。（C） 多倍体（多核和异常大）细胞百分比的时间进程。（D–F）直方图，显示不同有丝分裂阶段对照、INCENP阴性或极光B阴性有丝分裂细胞的百分比。INCENP地址：t吨=0，24；极光B在t吨=0时，由于缺乏空细胞，对整个有丝分裂群体进行评分。对于每个时间点，n个= 50.
图6
图6
INCENP和DmAurora B在正确定位方面相互依赖。（A） 控制中期在离散着丝粒斑点中显示INCENP（红色）。（B） 来自DmAurora B dsRNA处理细胞的罕见中期。INCENP在染色体臂上的分布比在对照组更为广泛。盒子仅显示INCENP染色。（C） DmAurora B RNAi后，INCENP在末期不会转移到纺锤体中央区或中心体（箭头）。（D） 在中身用DmAurora B（红色）控制末期。在INCENP RNAi后，DmAurora B从染色体（E）或末期中体（F）中完全游离。总之，微管是绿色的；DNA，蓝色）。棒材，5μm。
图7
图7
组蛋白H3磷酸化需要INCENP和DmAurora B，但不需要与动粒蛋白CENP-A/Cid结合。（A–F）磷-H3（绿色）和CENP-A/Cid（红色）。（A） 浓缩染色体缺乏可检测的磷酸化H3（来自同一图像的两个细胞，INCENP RNAi，36小时）。（B–D）标记CENP-A/Cid和磷酸化H3的正常有丝分裂染色体：中期（B）、早期后期（C）、晚期后期（D）。（E） 浓缩染色体缺乏可检测的磷酸化H3（来自同一图像的两个细胞，极光B RNAi，36小时）。（F） 磷酸化H3减少的矮胖染色体（极光B RNAi，36小时）。（G） 可检测的磷酸化H3水平（绿色方框）和局部染色质凝集（蓝色圆圈）之间只有微弱的相关性。注意磷-H3水平的极端分散。坐标：平均像素强度。横坐标：每个配对的蓝色圆圈和绿色方框分别表示457 nm和617 nm处三个背景校正像素强度测量值的不同单元格的平均值。457-nm测量值根据像素强度按升序排序。（H和I）表达（H）或缺乏（I）Dm Aurora-B（绿色，均来自极光B RNAi，36小时）的有丝分裂细胞中的染色质凝集水平相似。（J和K）前中期细胞中高水平的细胞周期蛋白B蛋白（红色）：对照RNA干扰（J）和极光B RNA干扰（K），表示合并；〃，表示磷-H3或极光B；‴，表示DNA（DAPI）。棒材，5μm。
图9
图9
去除DmINCENP会导致胞质分裂缺陷。（A、D和D′）未经处理的细胞的Telophase图。所有其他面板显示INCENP RNAi处理后的细胞。（A–C）将图像与INCENP（红色）、微管蛋白（绿色）和DNA（蓝色）合并。在INCENP RNAi后，与A中未经处理的细胞相比，B（箭头）中末期的中体缺少INCENP（红色）。（C）卵裂失败后两个细胞核之间保留的微管结构示例。（D–F）将肌动蛋白（红色）和DNA（蓝色）图像合并。晚期卵裂沟处肌动蛋白的积累不受INCENP去除的影响（与D和E相比）。然而，在双核细胞（F）的细胞核之间不存在肌动蛋白。（D′–F′）相应的INCENP图像。通过RNAi程序可以有效去除INCENP。（G） INCENP RNAi后72小时出现粗大多倍体细胞。微管放射状排列延伸到这些大大扩大的细胞的细胞皮层。棒材，5μm。
图8
图8
INCENP和极光B RNAi中的异常着丝粒分离和滞后染色质。（A和B）极点处有成对CENP-A/Cid斑点（红色）和滞后染色质的异常后期（INCENP RNAi，36小时）。（C和D）异常末期，在中体/中区有Cid斑点（INCENP RNAi，36小时）。（E） 中期和末期/G1细胞，后者显示具有双极微管阵列的伸长细胞核（INCENP RNAi，36小时）。中期细胞仍表达INCENP，但在异常的末期/G1细胞中未检测到。（F和G）香蕉形细胞核类似于E中所示的细胞核，显示由染色质连续体连接的Cid斑点簇分隔良好（极光B RNAi，36小时），表示合并（绿色，α-微管蛋白）；〃，用双箭头表示CENP-A/Cid，显示成对的Cid点‴，表示DNA（DAPI）。棒材，5μm。
图10
图10
DmINCENP或DmAurora B RNAi后，Pavarotti-KLP分布正常。（A） 野生型细胞中体显示PAV-KLP（红色）、微管蛋白（绿色）和DNA（蓝色）。（B） PAV-KLP（箭头）出现在INCENP RNAi后的中体。（C和D）DmAurora B RNAi后的异常末期。（C） 一种高度异常的多倍体细胞，有两个中体，均为PAV-KLP阳性（箭头）。（D） 胞质分裂失败后的双核细胞，在内化的中体残余物（箭头）处可见斑点PAV-KLP。（E） 直方图显示对照细胞或dsRNA处理细胞中DmAurora B或PAV-KLP中体染色阳性的末期细胞百分比。尽管DmAurora B RNAi去除了80%细胞（左侧）的DmAurora B染色，但与对照细胞相比，PAV-KLP染色仅去除了10%的末期细胞（右侧、红色、，n个= 30). 在INCENP RNAi中，94%的末期细胞（蓝条，n个= 95). 棒材，5μm。
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