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比较研究
.2001年4月；158(4):1379-90.
doi:10.1016/S0002-9440（10）64089-8。

慢性肝移植排斥反应中胆道上皮细胞的复制性衰老先于胆管丢失：p21（WAF1/Cip1）表达增加作为疾病标志物及免疫抑制剂的影响

J G Lunz第三 1, S Contrucci公司, K鲁珀特, N Murase公司, 冯俊杰（J J Fung）, T E Starzl公司, A J德米特里斯
附属公司
比较研究

慢性肝移植排斥反应中胆管上皮细胞的复制性衰老先于胆管损失：p21（WAF1/Cip1）作为疾病标志物的表达增加和免疫抑制药物的影响

J G Lunz第三等。 美国病理学杂志. 2001年4月.

摘要

早期慢性同种异体肝移植排斥反应（CR）的特征是胆道上皮细胞（BEC）发生独特的细胞学变化，在体外类似于细胞衰老，并先于胆管丢失。如果对早期CR患者进行积极治疗，CR的临床和组织病理学表现可以完全逆转，胆管丢失也可以预防。我们首先测试了在早期CR期间BEC中衰老相关p21（WAF1/Cip1）蛋白是否增加，以及治疗是否逆转表达。与正常肝移植活检或非特异性改变（1+/-1%和0.1+/-0.3；P:<0.0001和P:<0.02）、慢性丙型肝炎（2+/-3%和0.7+/-1；P:<0.0001和P:<0.04）或梗阻性胆管疾病（7+/-7%和0.7+/-0.6；P:<0006和P:=0.04）。早期CR的成功治疗与p21+BEC的百分比和每个门静脉道p21+BeC的数量减少有关。在体外，核p21（WAF1/Cip1）在大型和多核BEC中的表达增加，并由转化生长因子（TGF）-β诱导。TGF-beta1还增加TGF-beta受体II的表达，导致SMAD-2磷酸化和p21核移位（WAF1/Cip1），从而抑制BEC生长。因为从环孢素转化为他克莫司是早期CR的有效治疗方法，我们接下来测试这两种免疫抑制药物是否直接影响体外BEC的生长。结果表明，环孢素（而非他克莫司）刺激BEC TGF-β1的产生，进而导致BEC有丝分裂抑制和核p21（WAF1/Cip1）上调。总之，在早期CR期间，BEC中衰老相关p21（WAF1/Cip1）蛋白的表达增加，并随着成功恢复而减少。复制性衰老是用于早期CR诊断的特征性BEC细胞学改变以及缺乏对损伤的增殖反应的原因。环孢霉素抑制受损BEC生长的能力可能是他克莫司相对保留导管特性的原因。

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数字

图1。
图1。
答：早期CR染色p21的同种异体肝移植受者典型门静脉的高倍显微照片WAF1/Cip1（棕红色细胞核）。此活检在转化为他克莫司免疫抑制前8天进行，此时36%的BEC细胞核表达p21WAF1/Cip1蛋白质(箭头). 还注意到BEC细胞质增大和细胞核间距不均匀，这是早期CR的典型特征。B类：在服用他克莫司36天后，对同一患者进行重复活检，结果显示，与临床改善相一致，p21的百分比WAF1/Cip1+BEC下降到18%，细胞学改变逆转，如这一典型的门静脉道所示。抄送：该图显示了从环孢素转化为他克莫司对BEC p21的影响WAF1/Cip1早期CR或非特异性变化的肝移植活检中的表达。时间0的值是p21染色阳性的BEC百分比WAF1/Cip1在病人服用环孢素的最后一次活检中。这些线连接同一患者的连续活检。在时间0，注意p21的增加百分比WAF1/密码1+早期CR患者与非特异性改变患者的BEC比较。还要注意，p21的百分比WAF1/Cip1+早期CR患者改用他克莫司后BEC下降。相比之下，p21的百分比没有变化WAF1/Cip1+具有非特异性变化的活检或慢性HCV中的BEC（数据未显示）。
图2。
图2。
答：p21免疫组织化学染色WAF1/Cip1早期CR的同种异体肝活检（棕色细胞核）。注意BEC细胞学改变，包括多核化(箭头)核间距不均匀，细胞增大，p21增加WAF1/Cip1核标记。B类：p21免疫组织化学染色WAF1/Cip1在mBEC（棕色核）的原代培养中。注意胆管中受损的BEC与早期CR之间的相似性(A类和C类)原代培养物中衰老的mBEC增加。两种细胞群均显示多核和细胞质增大，偶尔细胞显示核固缩。还应注意，原代BEC培养物中的放大细胞和受损胆管中的BEC都表达核p21WAF1/Cip1，但较小的细胞则不然。C类和医生：p21早期CR活检序列切片染色WAF1/Cip1(C类)和Ki-67（Mib-1）(D类)表明BEC上调p21WAF1/Cip1与有丝分裂活动无关。
图3。
图3。
答：如材料和方法所述，在人胆管树外植体（hBDT）上测试了环孢素和他克莫司对人BEC生长的影响。平均而言，每个治疗组包括五个外植体培养物。连续6天，每2天测量一次培养物大小。注意对照组和含他克莫司的培养基中的培养物大小均增加，而环孢素处理的培养物的大小显著减少（*，P（P）< 0.02; **,P（P）与对照组或他克莫司处理的培养物相比<0.006）。B类：为了证明BEC培养物的缩小与有丝分裂抑制有关，在固定用于抗BrdU染色之前，培养物也用BrdU标记6或12小时。注意，与其他培养物相比，环孢素处理培养物中BrdU+BEC细胞核的百分比显著降低（*，P（P）< 0.01与用1000 ng/ml环孢素处理的BEC培养物）。
图4。
图4。
用增加浓度的环孢霉素（100至10000 ng/ml）处理保存在C-SFM中的mBEC，导致mBEC的浓度依赖性下降[三H] -与他克莫司（0.1至10000 ng/ml）处理的mBEC相比，48小时后胸腺嘧啶掺入。所示结果代表了至少三个单独的实验（*，P（P）< 0.01; **,P（P）< 0.001; ***,P（P）< 0.0003).
图5。
图5。
答：用环孢霉素（5000 ng/ml）处理保存在C-SFM中的mBEC，而不是用他克莫司（1000 ng/ml。如果通过切换到简单无血清培养基（S-SFM）阻止mBEC生长（参见材料和方法），TGF-β的生成也会增加。B类：密度追踪和与GAPDH mRNA的比较表明，环孢素处理的培养物中TGF-βmRNA的生成高于他克莫司处理的培养液。将药物添加到保存在C-SFM中的mBEC培养物中24小时后进行测定。所示结果代表了三个单独的实验。抄送：根据标准酶联免疫吸附试验（*，P（P）< 0.005).
图6。
图6。
答：与C-SFM对照组相比，用环孢素（1000 ng/ml）或TGF-β（10 ng/ml(左边)由Western blotting测定。密度描记法用于说明定量差异(正确的).B类：TGF-β信号通路由转录因子SMAD-2的磷酸化介导。在这个西方污点(左边)在用环孢素（1000 ng/ml）处理的mBEC中检测到磷酸-SMAD-2，而在用他克莫司（1000 ng/ml）处理的细胞中未检测到磷酸化SMAD-2。阳性对照组包括用10 ng/ml外源性TGF-β处理的mBEC。使用密度追踪法来说明定量差异(正确的).抄送：在这个Western blot中，BEC核蛋白被检测为细胞周期素依赖性激酶抑制剂蛋白p21WAF1/Cip1TGF-β（10 ng/ml；阳性对照）或环孢素（1000 ng/ml）治疗48小时后升高，但对照C-SFM或他克莫司（1000 ng/ml）治疗后没有升高。
图7。
图7。
同时向C-SFM中的mBEC添加1000 ng/ml环孢霉素和中和抗TGF-β抗体，导致细胞内的浓度依赖性增加[三H] -与1000 ng/ml环孢素和对照非免疫性免疫球蛋白处理的mBEC相比，48小时后胸腺嘧啶掺入。这一结果进一步证实了BEC生长的抑制，在体外，通过TGF-β介导。显示的结果代表了两个单独的实验（*，P（P）< 0.002; **,P（P）< 0.0003).
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