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。2001年3月；12（3）：615-27。
doi:10.1091/mbc.12.3.615。

GIPC和GAIP与TrkA形成复合物：G蛋白和受体酪氨酸激酶途径之间的假定联系

X楼 1, H亚诺, F李, M V Chao先生, M G Farquhar先生
附属公司
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GIPC和GAIP与TrkA形成复合物：G蛋白和受体酪氨酸激酶途径之间的假定联系

X楼等。 分子生物学细胞。 2001年3月。
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摘要

NGF通过促进酪氨酸激酶受体TrkA的激活来启动其大部分神经营养作用。在这里，我们描述了TrkA和GIPC（PDZ域蛋白）之间的一种新的相互作用。GIPC通过其PDZ结构域与TrkA的膜旁区域结合。GIPC的PDZ结构域还与GAIP相互作用，GAIP是一种RGS（G蛋白信号调节蛋白）蛋白。GIPC和GAIP是G蛋白偶联信号复合物的组成部分，被认为与囊泡运输有关。在转染的HEK 293T细胞中，GIPC、GAIP和TrkA形成一种共沉淀蛋白复合物。TrkA和GAIP都绑定到GIPC的PDZ域，但它们在PDZ域中的绑定位点不同。通过稳定表达TrkA的PC12（615）细胞的共免疫沉淀证实了内源性GIPC与TrkA受体的关联。通过免疫荧光，GIPC与磷酸化TrkA受体在位于分化PC12（615）细胞的神经突和胞体的逆行运输小泡中共定位。这些结果表明，GIPC与其他PDZ结构域蛋白一样，可以将跨膜受体与信号分子聚集在一起。当GIPC在PC12（615）细胞中过度表达时，NGF诱导的丝裂原活化蛋白（MAP）激酶（Erk1/2）磷酸化降低；然而，对Akt、磷脂酶C-gamma1或Shc的磷酸化没有影响。TrkA受体与GIPC和GAIP的关联以及GIPC对MAP激酶的抑制表明，GIPC可能在TrkA和G蛋白信号通路之间提供联系。

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数字

图1
图1
GIPC与TrkA和TrkB的免疫共沉淀。全长GIPC和TrkA或TrkB在HEK293T细胞，然后是细胞裂解物的免疫沉淀（IP）（50μg）含亲和纯化抗Trk（C-14）IgG和带有抗GIPC（顶部）和抗Trk的免疫印迹（IB）血清（中）。GIPC与TrkA（车道2）和TrkB（3号车道）。在裂解物的免疫沉淀物中未检测到GIPC转染GIPC和空载体的细胞（第1道）。这个GIPC的蛋白表达水平在每个通道（底部）是可比较的。
图2
图2
绘制TrkA中的GIPC相互作用区域。（A） TrkA和旁膜结构域缺失突变体。GIPC与右侧显示的TrkA突变体基于B的数据。（+，相互作用；−，无交互作用；TM，跨膜区；IgC2，类Ig C2-型结构域。）。（B） GIPC免疫共沉淀TrkA缺失突变体。顶部面板，全长TrkA，神经生长因子受体1–522、TrkA1–501、和神经生长因子受体1–493与GIPC-FLAG共沉淀（2-5车道），但未观察到与TrkA的相互作用1–472或神经生长因子受体1–452（6号和7号车道）。第二个面板，数量GIPC-FLAG沉淀物在所有车道上都具有可比性。标记为FLAG的GIPC在HEK293T细胞中瞬时共表达全长（第2车道）或TrkA缺失突变体（3–7道）或仅FLAG-GIPC（1道）。单元格用抗FLAG免疫沉淀（IP）裂解产物，然后使用抗TrkA RTA的免疫印迹（IB）（顶面板）或防FLAG（第二个面板）。TrkA突变体的蛋白表达水平（第三个面板）和FLAG-GIPC（底部面板）在50μg细胞裂解液中具有可比性。
图3
图3
绘制TrkA与GIPC的相互作用缺失突变体。（A） 鼠标GIPC删除的示意图突变体。GIPC突变体与神经生长因子受体448–522右边显示的是基于B的数据。（+，相互作用；−，无相互作用）。（B） 左，体外相互作用TrkA与GIPC截短突变体相邻的膜区。GIPC公司81–333（2车道），GIPC125–333（PDZ+C）（车道4） 和GIPC125–225（PDZ）（车道10）绑定到GST-TrkA公司448–522但不单独涉及GST（泳道1、3和9），而GIPC1–124（N） （车道6）或GIPC公司226–333（C） （车道8）未绑定到GST-TrkA公司448–522.GST-TrkA448–522或仅GST固定在谷胱甘肽上-用体外翻译显示，35S标记GIPC突变体蛋白质。这个35与珠结合的S标记蛋白为SDS-PAGE分离，放射自显影检测。对，一个通过SDS-PAGE解析每个体外翻译产物的等分试样并通过放射自显影检查以确认蛋白质产量和分子大小。
图4
图4
TrkA与内源性PC12（615）细胞中的GIPC。（A） Top，TrkA与内源性对照组（1号通道）和NGF处理组（2号和3号通道）细胞中的GIPC。在NGF前添加100 nM K252a，一种特异性Trk激酶抑制剂治疗对相互作用没有影响（车道4）。很少或没有TrkA在用免疫前血清获得的沉淀物中可见（车道5和车道6）。中间，免疫（1-4道）中存在GIPC，但不存在免疫前沉淀物（车道5、6）通过以下方法进行验证免疫印迹法。底部，一小份裂解液用抗Trk（C-14）IgG和用抗磷酸酪氨酸（PY99）IgG免疫印迹验证NGF对TrkA的激活（通道2和3）。PC12（615）细胞在低血清培养基中培养过夜用100 ng/ml NGF处理0、10或30分钟。细胞裂解物（3.7 mg）用抗GIPC或免疫前血清免疫沉淀（IP）然后用抗Trk（B-3）进行免疫印迹（IB）（顶部）或抗GIPC（中部）。（B） 磷酸化TrkA（箭头）在所有时间点（7、30和60）与内源性GIPC共沉淀分钟），但不在未处理样品中（车道2）或免疫前血清沉淀（车道1）。PC12（615）用100 ng/ml的NGF处理细胞，如A中的细胞裂解物（3.3 mg）用抗GIPC或免疫前血清免疫沉淀然后用抗磷酸酪氨酸进行免疫印迹PY99（顶部）或抗GIPC（底部）。
图5
图5
TrkA、GIPC和GAIP形成一个免疫沉淀蛋白复合物。（A） GAIP（～25 kDa）共沉淀物GIPC（～40 kDa）。pcDNA3.1-mGIPC和pcDNA3-hGAIP暂时共转染HEK293细胞，然后用[35S] 蛋氨酸。细胞裂解物被免疫沉淀（IP）使用免疫前（1道）或抗GIPC（2道）血清。（B） 复制按照A中的方法进行共免疫沉淀，然后抗GIPC（顶部）或抗GAIP免疫印迹（底部）验证25 kDa频带的GAIP身份。GAIP是在免疫系统（通道2）中检测到，但在免疫前（通道1）中检测不到猛然扔下。（C） TrkA、GIPC和GAIP的免疫共沉淀。pCMV5-TrkA（车道2和4）或空矢量（车道1和3）为在HEK293细胞中与pcDNA3.1-mGIPC和pcDNA3-hGAIP共表达。用抗Trk（C-14）免疫沉淀裂解液（2和4道）随后用抗Trk（44）进行免疫印迹（顶部），抗GIPC（中间）和抗GAIP（底部）抗血清。GIPC和GAIP在三种基因均转染的细胞中与TrkA共免疫沉淀蛋白质（通道2），但在转染GIPC、GAIP、，和空矢量（车道1）。50μg细胞中的表达水平裂解产物显示在第3和第4道。
图6
图6
TrkA之间缺乏直接互动和GAIP。（A） 体外翻译35S-GAIP绑定到GST-GIPC（车道4）但不与GST-TrkA绑定448–522（泳道3）或单独的GST（泳道2）。第一道展示了一份试管婴儿翻译35S-GAIP。GST-TrkA公司448–522或GST单独固定在谷胱甘肽上-脑葡萄糖珠与in孵育体外翻译35S-GAIP。这个35S-GAIP绑定用SDS-PAGE分离微球，并用放射自显影法检测。（B） 体外翻译35S-GAIP未绑定到TrkA（通道3）或蛋白质A-琼脂糖珠单独（通道2）。35S-GIPC公司PDZ+C（用作正极控件）绑定到TrkA（通道4）。车道1和车道5各显示一份体外翻译产物。TrkA在HEK293细胞，用抗Trk（C-14）免疫沉淀，然后用蛋白A-琼脂糖珠培养。珠子洗过了广泛使用RIPA缓冲液并用体外翻译培养35S-GAIP或35S-GIPC公司PDZ+C。35结合到珠子上的S标记蛋白质通过SDS-PAGE和放射自显影检测。
图7
图7
TrkA和GAIP绑定到PDZ中的不同站点GIPC域。（A） GIPC（L142A/G143E）与GAIP。C端子标记有FLAG的GIPC（车道1、3和5）或GIPC（L142A/G143E）突变体（泳道2、4和6）与GAIP共表达在HEK293细胞中。GIPC由细胞裂解物免疫沉淀（IP）带有抗GIPC（通道1和2）或抗FLAG（M2）抗体（通道5和6） 沉淀物经免疫印迹（IB）反GIPC（顶部）和反GAIP（底部）。GAIP与野生型GIPC（车道1和5），但不带GIPC（L142A/G143E）突变体（车道2和6）。蛋白质表达水平（通道3和通道4）为具有可比性。~40 kDa（顶部，1-4车道）处的双频段表示内源性GIPC（•）和过度表达GIPC-FLAG（○）。IgG HC，IgG沉重的链条。GAIP正上方和正下方的两个频带（车道1和2）是IgG轻链。（B） GIPC（L142A/G143E）结合TrkA。C端FLAG标记的GIPC或GIPC（L142A/G143E）与TrkA（车道1、2、5和6）或空矢量（车道3、4、7和8）inHEK293细胞。用抗TrkA（C-14）免疫沉淀裂解液（泳道1-4）或抗FLAG（泳道5-8）IgG，然后用抗TrkA免疫印迹法（44）（顶面板）或anti-GIPC（第二个面板）。野生型GIPC（车道1）和GIPC与TrkA共转染细胞中的突变体（第2道）共沉淀物TrkA公司。类似地，TrkA与两种野生型GIPC-FLAG共沉淀（车道5）和突变型GIPC-FLAG（车道6）。无GIPC（车道3和7）或从样品中沉淀GIPC（L142A/G143E）（通道4和8与空载体共转染。TrkA蛋白表达水平（第三个面板）和GIPC（底部面板）如图所示。
图8
图8
TrkA的免疫荧光分布。神经生长因子受体在细胞体的囊泡结构（星号）内检测到，沿着PC12的轴突和轴突末端（箭头）细胞稳定过度表达TrkA。PC12（615）细胞用50ng/ml NGF隔夜刺激分化和生长神经突。细胞固定在甲醇中，用多克隆标记抗TrkA（C-14；识别TrkA和p-TrkA），并由共焦显微镜。棒材，10μm。
图9
图9
Tyr496的共分布-磷酸化TrkA（p-TrkA）和内源性GIPC或内源性GAIP免疫荧光。内源性GIPC（A）和p-TrkA（B）广泛存在分布于胞体、神经突和神经突的小泡内PC12（615）细胞的末端。合并图像中的黄色信号（C）展示GIPC和p-TrkA重叠的区域。内源性增益收益显示泡状分布（D），比GIPC更精细。GAIP（D）和TrkA（E）染色重叠较少（F）。PC12公司用50 ng/ml NGF处理（615）细胞过夜，以使其生长神经突。细胞固定，用抗TrkA mAB E-6双重标记（仅识别p-TrkA）和多克隆抗GIPC或抗GAIP，以及用共焦显微镜检查。棒材，10μm。
图10
图10
内源性GIPC和TrkA与溶酶体标记。内源性GIPC（A）的免疫荧光染色显示与lgp120（B）的重叠很少，因为实际上没有在合并图像（C）中可以看到重叠的黄色信号。同样，TrkA（D）与组织蛋白酶D（E）不协同作用。双重标签在NGF诱导的分化PC12（615）中进行，如图8所示多克隆抗GIPC和单克隆抗体抗gp120或抗TrkA（E-6）和多克隆抗组织蛋白酶D.Bar，10μm。
图11
图11
GIPC过度表达抑制NGF诱导磷酸化MAP激酶（Erk1和2），但对Akt、PLC-γ1或Shc的磷酸化。（A） PC12（615）细胞（克隆7和11）稳定过度表达GIPC（3–6车道）或空向量（通道1和通道2）在含有1.5%血清的培养基中培养过夜。用100 ng/ml NGF处理细胞5分钟，之后细胞用抗p-Erk1/2对裂解产物（50μg）进行免疫印迹（顶部面板）或防Erk1/2（第二个面板）。Erks的磷酸化（p-Erk1/2）在NGF刺激的细胞中稳定过度表达GIPC（车道4和6）与空矢量控制（车道2）进行比较。在没有NGF刺激的情况下，未检测到p-Erk1/2（通道1、3、，和5）。表达的Erk1/2总量（第二个面板）为在所有条件下都具有可比性。TrkA（第三面板）和GIPC的数量（底部面板）用50μg细胞裂解液表达。（B） PC12（615）稳定过度表达GIPC的细胞（克隆7和69）（3–6区）或那些表达空向量（车道1和车道2）的被生长并处理为细胞裂解物（50μg）免疫印迹抗p-Akt、抗-Akt、反p-Erk1/2或反Erk1/2。相同的裂解物用抗PLC-γ1 IgG免疫沉淀（700μg），然后用抗磷酸酪氨酸4G10免疫印迹（p-PLC-γ1）。相同的膜被剥离并重新缝合抗PLC-γ1（PLCγ1）。Akt（p-Akt）和PLC-γ1的磷酸化（p-PLC-γ1）在NGF刺激的细胞中稳定过度表达GIPC4和6）与用空转染的对照相比没有变化载体（泳道2），而Erks的磷酸化（p-Erk1/2）是与转染空基因的对照组相比减少了（第4和第6通道矢量（车道2）。注意Akt、PLC-γ1和Erk1/2的量表示在所有条件下都是可比较的。底部，GIPC数量在50μg细胞裂解液中。（C） PC12（615）细胞（克隆7和69）GIPC稳定过度表达（3–6通道）或表达空载体（通道1和2）的生长和处理与A.裂解物（700μg）用抗Shc IgG免疫沉淀，然后抗磷酸酪氨酸4G10（p-Shc，顶部面板）。对相同的裂解物（50μg）进行免疫印迹带有anti-p-Erk1/2（第二个面板）或anti-Erk1/2（第三个面板）。中所有三种形式的Shc（48、53和68 kDa）的磷酸化NGF刺激的细胞稳定过度表达GIPC（通道4和6）是与转染空载体的对照组（第2通道）相似，而与之相比，Erks的磷酸化（p-Erk1/2）减少（通道4和6对照组转染空载体（第2通道）。车道1、3和5显示p-Shc的基础水平。Erk总量（Erk1/2）表示在所有条件下都是可比较的。
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