A truncated form of the human CAF-1 p150 subunit impairs the maintenance of transcriptional gene silencing in mammalian cells

doi:10.1128/MCB.21.6.1953-1961.2001

比较研究

.2001年3月；21(6):1953-61.

doi:10.1128/MCB.21.6.1953-1961.2001。

人类CAF-1 p150亚单位的截短形式损害哺乳动物细胞中转录基因沉默的维持

T切尼奥¹, J F卡塞拉, T海德曼

附属公司

PMID： 11238931
预防性维修识别码：项目管理委员会86785
内政部： 10.1128/MCB.21.6.1953-1961.2001

比较研究

人类CAF-1 p150亚单位的截短形式损害哺乳动物细胞中转录基因沉默的维持

T切尼奥等。分子细胞生物学. 2001年3月.

.2001年3月；21（6）：1953-61年。

doi:10.1128/MCB.21.6.1953-1961.2001。

作者

T切尼奥¹, J F卡塞拉, T Heidmann公司

附属

¹法国维尔尤夫古斯塔夫·鲁西研究所，CNRS UMR 1573，邮编94805。tchenio@infobiogen.fr

PMID： 11238931
预防性维修识别码：项目管理委员会86785
内政部： 10.1128/MCB.21.6.1953-1961.2001

摘要

染色质组装因子1（CAF-1）是由三个亚单位p150、p60和p48组成的蛋白质复合体，从酿酒酵母保存到人类，可以促进核小体组装到新复制的DNA上。在酿酒酵母中，编码三种CAF-1亚单位中任何一种的基因（cacDelta突变体）的缺失虽然不会致命，但会导致封装在异染色质中的基因出现沉默缺陷。在这里，我们报道了一种哺乳动物细胞模型，该模型用于定量监测基因沉默及其逆转。该模型依赖于使用在沉默状态下稳定转染有报告基因的细胞系。用5-氮杂胞苷处理细胞后，报告基因沉默得到逆转，导致报告基因拷贝去甲基化。我们表明，携带5'截短的人类p150 CAF-1亚单位的cDNA表达，而不是编码全长p150 CAF1亚单位的基因表达，增加了500倍以上的频率，在这些细胞中，报告基因拷贝的转录沉默被逆转。基因沉默的逆转取决于截短蛋白的表达，可能是野生型CAF-1的显性阴性突变，与核酸内切酶敏感性试验测定的染色质结构改变有关，与沉默基因甲基化状态的可检测变化无关。这些结果表明，尽管酵母染色质中缺乏DNA甲基化，但CAF-1在基因表达的表观遗传控制中的作用在酵母和哺乳动物之间是保守的。

PubMed免责声明

数字

图1
转录基因沉默的哺乳动物细胞模型。（A）的结构*四氧化二铁*PneoIRESlacZ报告基因。这个*四氧化二铁*四环素可抑制tTA反式激活子结合的调节序列，最小P_CMV公司*发起人，以及新和*lacZ公司*显示了ORF；内部核糖体进入位点（IRES）可以同时翻译新和*lacZ公司*内部ORF四氧化二铁P-启动的转录物。（B）沉默sil-B细胞的构建。最初选择小鼠成纤维细胞PA12细胞是因为其包装逆转录病毒转录物的能力（15），这一特征在本试验中未使用，实际上在潮霉素选择过程中丢失。图中显示了获得的连续细胞克隆及其表型（括号中）。虚线对应于用荧光素酶报告子和嘌呤霉素耐药编码载体转染细胞后>2个月的培养期（前一载体的活性未用于本系列实验）；tTA表达载体(*tetO公司*PLi-tTA）包含在串联控制下的tTA四氧化二铁P和LINE-1启动子（参见材料和方法）。（C）核试运行分析*四氧化二铁*sil-B细胞和对照中的PneoIRESlacZ基因（CAFΔ1178 G418^第页sil-B回复体[图2]）细胞。合成Run-on转录物并与限制性λ噬菌体DNA的Southern blots杂交，作为对照或含有新或β-肌动蛋白（β-act）DNA片段（箭头）。（D）由G418制成的A、B、sil-B细胞和对照A细胞中的tTA活性^第页感染tTA逆转录病毒表达载体（a/tTA）后。用质粒pUHC13-3（携带荧光素酶报告基因，受基因控制）瞬时转染指示细胞后，检测tTA活性*四氧化二铁*P启动子，*四氧化二铁*Pluc），并在培养基中不含和含四环素的细胞中测量荧光素酶活性。这些值是五个以上独立转染实验的平均值，每个实验重复进行荧光素酶分析，并测量共转染CMVβ质粒的β-半乳糖苷酶活性，以控制转染效率（居民的β-乳糖酶活性*四氧化二铁*与CMVβ相比，PneoIRESlacZ报告基因在所有情况下都可以忽略不计。条形图表示标准偏差。（E）的诱导性*四氧化二铁*sil-B和对照A细胞中的PneoIRESlacZ报告基因。用tTA表达载体（pUHD15-1，由hCMV强即刻早期启动子驱动的tTA表达向量）或具有相同启动子的对照（c）载体瞬时转染细胞，转染后2天测定β-半乳糖苷酶活性。

图2
的反转*四氧化二铁*sil-B细胞中的PneoIRESlacZ基因沉默。（A）细胞分析的原理。用5-氮杂胞苷（5-azaC；10μM，持续1天）或用指示基因的逆转录病毒表达载体感染Sil-B细胞。七天后，对产生的非选择细胞群进行G418选择，以检测*tetO公司*PneoIRESlacZ静音，通过G418的出现频率（每个细胞）测量^第页细胞克隆。从非选择细胞群和G418中提取RNA^第页用于Northern杂交分析的细胞。（B）反转*四氧化二铁*使用指定的表达载体或5-氮杂胞苷治疗sil-B细胞感染后，PneoIRESlacZ基因沉默。所示频率是四个独立实验的平均值，标准偏差由条形图表示。对照组G418的选择是在整个选择过程中添加0.5μg/ml四环素的情况下进行的。使用a细胞（未显示）在平行感染实验中测试tTA表达载体的功能。（C） Northern印迹分析*四氧化二铁*PneoIRESlacZ转录本。从感染了指示表达载体的sil-B细胞中提取多聚腺苷化RNA（从25μg总RNA中分离），从G418中提取^第页细胞回复物（CAFΔ1178 G418^第页)和来自G418^第页感染tTA表达载体（tTA/G418）后获得的细胞^第页). 这些斑点与新或使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）探针作为对照。两个主要职位*四氧化二铁*PneoIRESlacZ转录本用箭头表示。（D）多重杂交的Southern blot分析*四氧化二铁*PneoIRESlacZ基因在sil-B细胞（无）和衍生G418中的复制^第页回复子（CAFΔ1178/G418^第页和5-azaC/G418^第页). 提取的DNA被切割成巴姆HI（转染质粒中的两个限制性位点，均位于新在内部*四氧化二铁*PneoIRESlacZ）或生态RV（一个限制位置，英寸拉奇). 这些斑点与新探查。

图3
甲基化和染色质可及性*四氧化二铁*PneoIRESlacZ基因。（A）甲基化状态*四氧化二铁*PneoIRESlacZ基因。提取所示细胞的细胞DNA并用生态0109I单独（E）或与生态0109I加上甲基化敏感*消息传递程序*I（+M）或甲基化敏感*血红蛋白*II（+H）酶（相同的识别序列）。通过Southern杂交和新探查。的相应区域的结构*四氧化二铁*图的上部是PneoIRESlacZ基因的示意图，其限制位点的位置用于*消息传递程序*我和*血红蛋白*II和for生态0109I由竖线表示。受试细胞包括A细胞、sil-B细胞和用5-氮杂胞苷（5-azaC；10μM，1天）处理sil-B电池或感染MoSV-CAFΔ1178和G418选择后获得的回复体。G418型^第页细胞群一直保持在G418选择压力下，直到细胞裂解以提取细胞DNA。（B）内切酶保护试验*四氧化二铁*PneoIRESlacZ基因。约5×10⁶按照材料和方法中的描述，从所示细胞中分离细胞核，并用0、33和100 U的上海限制性内切酶。然后对DNA进行纯化，用生态0109I释放1.75-kb亲本片段，并通过Southern blotting和新探头（B，左侧）。1.75-kb片段的位置由箭头和三个片段的箭头指示新-杂交片段上海I箭头限制（参见面板上部的方案，以及上海我和生态0109I用竖线表示的场地）。百分比*四氧化二铁*PneoIRESlacZ基因拷贝被切割上海我是通过荧光成像仪分析（B，右）定量的。纵坐标是包含在*Sst公司*每个酶浓度下的I-切割片段。IRES，内部核糖体进入位点。

图4
CAFΔ1178介导的基因沉默逆转相关翻译产物的特征。（A）截断翻译产品的要求。用逆转录病毒表达载体（MoSV）感染sil-B细胞，以获得完整的CAF-1 p150、CAFΔ1178和通过删除位置2304至2307处的四个核苷酸（面板D中的星号）从CAF△1178衍生的移码突变体（CAFΔ的1178*）。G418的指示频率^第页每个感染细胞群体的分离细胞（感染细胞的百分比接近10%）是三个独立实验的平均值，标准偏差用bars表示。（B）使用人CAF-1 p150蛋白特异性单克隆抗体，对感染所示逆转录病毒表达载体的小鼠sil-B细胞和对照人HeLa细胞的内源性CAF-1细胞提取物进行Western blot分析。感染MoSV-CAFΔ1178的sil-B细胞，在感染前（CAFΔ1178CAF△1178/G418^第页)G418选择，120μg用于所有其他细胞提取物。（C） CAF-1和5′-截断衍生物的体外翻译试验（见面板D）。箭头表示150kDa和70-74kDa产品。（D）完整p150 CAF-1亚单位和衍生物的结构。根据参考文献和，对先前确定的CAF-1功能域进行了图解。数字是指cDNA序列中的核苷酸位置。星号（位置2304）对应一个唯一的囊II位点用于在CAFΔ1178内引入移码（移码密码子由阴影域表示）。MW，分子量（重量单位为千）；增殖细胞核抗原；MIR、MOD1相互作用区。

请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

缺乏染色质组装因子I的酿酒酵母细胞对紫外线辐射的敏感性和端粒沉默的减少。
考夫曼PD、小林R、斯蒂尔曼B。考夫曼PD等人。基因开发1997年2月1日；11(3):345-57. doi:10.1101/gad.11.3.345。基因开发1997。 PMID：9030687
由CAF-1和乙酰化组蛋白H3/H4复合物组装核小体。
Verreault A、Kaufman PD、Kobayashi R、Stillman B。 Verreault A等人。细胞。1996年10月4日；87(1):95-104. doi:10.1016/s0092-8674（00）81326-4。细胞。1996 PMID：8858152
甲基CpG结合蛋白MBD1与染色质组装因子1的p150亚基相互作用。
Reese BE、Bachman KE、Baylin SB、Rountree MR。 Reese BE等人。分子细胞生物学。2003年5月；23(9):3226-36. doi:10.1128/MCB.23.93226-3236.2003。分子细胞生物学。2003 PMID：12697822 免费PMC文章。
染色质组装复合体（CAF-1）及其p60亚单位（CHAF1b）在体内平衡和疾病中的作用。
Volk A，Crispino法学博士。 Volk A等人。 Biochim生物物理学报。2015年8月；1849(8):979-86. doi:10.1016/j.bbagrm.2015.05.009。Epub 2015年6月9日。 Biochim生物物理学报。2015 PMID：26066981 免费PMC文章。审查。
CAF-1与染色质状态的遗传：处于DNA复制和修复的十字路口。
里奇韦·P，阿尔穆兹尼·G。 Ridgway P等人。细胞科学杂志。2000年8月；113（第15部分）：2647-58。doi:10.1242/jcs.113.15.2647。细胞科学杂志。2000 PMID：10893180 审查。

查看所有类似文章

引用人

染色质组装因子1最大亚单位P150的翼螺旋结构域的生化和结构见解。
Ayoub J、Buonano M、Di Fiore A、De Simone G、Monti SM。 Ayoub J等人。国际分子科学杂志。2022年2月15日；23(4):2160. doi:10.3390/ijms23042160。国际分子科学杂志。2022 PMID：35216276 免费PMC文章。
CAF-1/p150促进宫颈癌患者的细胞增殖、迁移和侵袭，并预测其预后不良。
杨S、龙Q、陈M、刘X、周H。 Yang S等人。 Oncol Lett公司。2020年9月；20(3):2338-2346. doi:10.3892/ol.2020.11775。Epub 2020年6月25日。 Oncol Lett公司。2020 PMID：32782551 免费PMC文章。
组蛋白伴侣CAF-1与DNA甲基转移酶协同维持抄送4细胞毒性T细胞沉默。
Ng C、Aichinger M、Nguyen T、Au C、Najar T、Wu L、Mesa KR、Liao W、Quivy JP、Hubert B、Almouzni G、Zuber J、Littman DR。 Ng C等人。基因开发2019年6月1日；33(11-12):669-683. doi:10.1101/gad.322024.118。Epub 2019年4月11日。基因开发2019。 PMID：30975723 免费PMC文章。
CHAF1A与TCF4相互作用，通过上调c-MYC和CCND1的表达促进胃癌的发生。
郑磊、梁晓霞、李思敏、李婷、尚伟、马莉、贾晓霞、邵伟、孙鹏、陈C、贾杰。郑磊等。 EBioMedicine公司。2018年12月；38:69-78. doi:10.1016/j.ebiom.2018.11.009。Epub 2018年11月16日。 EBioMedicine公司。2018 PMID：30449701 免费PMC文章。
HP1与CAF-1合作，在哺乳动物细胞中压缩异色转基因重复序列。
闫H，向X，陈Q，潘X，程H，王F。 Yan H等人。科学报告，2018年9月20日；8(1):14141. doi:10.1038/s41598-018-32381-7。 2018年科学报告。 PMID：30237539 免费PMC文章。

查看所有“被引用”文章

工具书类

1. Bestor T H.甲基化与乙酰化。自然。1998;393:311–312.-公共医学
1. Bird A P、Wolffe A P。甲基化诱导的抑制床、支架和染色质。细胞。1999;99:451–454.-公共医学
1. Bulger M，Ito T，Kamakaka T T，Kadonaga J T。通过果蝇染色质组装因子1和56-kDa组蛋白结合蛋白组装规则间隔的核小体阵列。美国国家科学院院刊，1995年；92:11726–11730.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Dombroski B A，Mathias S L，Nanthakumar E，Scott A F，Kazazian H H。活性人类转座因子的分离。科学。1991;254:1805–1808.-公共医学
1. Enomoto S，Berman J.染色质组装因子I有助于维持而非重建酵母沉默交配位点的沉默。基因开发1998；12:219–232。-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

行动
行动

MeSH术语

行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动
行动

LinkOut-更多资源

全文源
其他文献来源
- 镜片-专利引文

[1] Bestor T H.甲基化与乙酰化。自然。1998;393:311–312.-公共医学

[2] Bestor T H.甲基化与乙酰化。自然。1998;393:311–312.-公共医学

[3] Bird A P、Wolffe A P。甲基化诱导的抑制床、支架和染色质。细胞。1999;99:451–454.-公共医学

[4] Bird A P、Wolffe A P。甲基化诱导的抑制床、支架和染色质。细胞。1999;99:451–454.-公共医学

[5] Bulger M，Ito T，Kamakaka T T，Kadonaga J T。通过果蝇染色质组装因子1和56-kDa组蛋白结合蛋白组装规则间隔的核小体阵列。美国国家科学院院刊，1995年；92:11726–11730.-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Bulger M，Ito T，Kamakaka T T，Kadonaga J T。通过果蝇染色质组装因子1和56-kDa组蛋白结合蛋白组装规则间隔的核小体阵列。美国国家科学院院刊，1995年；92:11726–11730.-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Dombroski B A，Mathias S L，Nanthakumar E，Scott A F，Kazazian H H。活性人类转座因子的分离。科学。1991;254:1805–1808.-公共医学

[8] Dombroski B A，Mathias S L，Nanthakumar E，Scott A F，Kazazian H H。活性人类转座因子的分离。科学。1991;254:1805–1808.-公共医学

[9] Enomoto S，Berman J.染色质组装因子I有助于维持而非重建酵母沉默交配位点的沉默。基因开发1998；12:219–232。-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Enomoto S，Berman J.染色质组装因子I有助于维持而非重建酵母沉默交配位点的沉默。基因开发1998；12:219–232。-项目管理咨询公司-公共医学

将引文保存到文件

电子邮件引文

添加到集合

添加到我的书目

您保存的搜索

为外部引文管理软件创建文件

您的RSS源

人类CAF-1 p150亚单位的截短形式损害哺乳动物细胞中转录基因沉默的维持

附属

人类CAF-1 p150亚单位的截短形式损害哺乳动物细胞中转录基因沉默的维持

作者

附属

摘要

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

LinkOut-更多资源

全文源

其他文献来源

摘要

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

相关信息

LinkOut-更多资源

全文源

其他文献来源