Regulation of cellular growth by the Drosophila target of rapamycin dTOR

doi:10.1101/gad.835000

比较研究

.2000年11月1日；14(21):2712-24.

doi:10.1101/gad.835000。

雷帕霉素dTOR靶向果蝇对细胞生长的调控

H张¹, J P失速, J C Ng公司, C莱因哈德, T P Neufeld公司

附属公司

PMID： 11069888
预防性维修识别码：下午3点17034分
DOI（操作界面）： 10.1101/gad.835000

比较研究

雷帕霉素dTOR靶向果蝇对细胞生长的调控

H张等。基因开发. 2000.

.2000年11月1日；14(21):2712-24.

doi:10.1101/gad.835000。

作者

H张¹, J P失速, J C Ng公司, C莱因哈德, T P Neufeld公司

附属

¹美国加利福尼亚州埃默里维尔市凯龙公司，邮编：94608。

PMID： 11069888
预防性维修识别码：下午3点17034分
DOI（操作界面）： 10.1101/gad.835000

摘要

TOR蛋白激酶（酵母中的TOR1和TOR2；哺乳动物中的mTOR/FRAP/RAFT1）促进细胞增殖以响应营养素和生长因子，但其在发育中的作用尚不清楚。在这里，我们表明，果蝇TOR同源物dTOR是细胞在幼虫发育过程中自主生长和增殖所必需的，也是磷酸肌醇3-激酶（PI3K）信号通路激活引起的细胞生长增加所必需的。与哺乳动物细胞一样，dTOR的激酶活性是体外p70 S6激酶（p70（S6K））的生长因子依赖性磷酸化所必需的，我们证明在体内过度表达p70（S6K）可以挽救dTOR突变动物的生存能力。dTOR的缺失也会导致氨基酸缺乏的细胞表型特征，包括核仁尺寸减小、幼虫脂肪体中的脂质小泡聚集，以及细胞类型特异性的细胞周期阻滞模式，这种细胞周期阻滞可以通过S期调节因子cyclin E的过表达绕过。我们的结果表明，dTOR通过将生长因子信号与营养物质可用性耦合来调节动物发育过程中的生长。

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图1
的比较*果蝇属*和人类TOR蛋白。使用ClustalW 1.8算法对齐dTOR和人类mTOR/FRAP的氨基酸序列（GenBank登录号744518）。暗盒表示相同的氨基酸；灰色方框表示相似性。强调了保守的FKBP12–雷帕霉素结合域（mTOR中的氨基酸2025–2114；Villella-Bach等人，1999），该域中的必需丝氨酸用星号表示。mTOR自动磷酸化（Ser-2481）和Akt/PKB磷酸化（Ser-2448）的位点用克拉标记。

图2
dTOR突变抑制幼虫生长。(A类)8.0-kb的结构*数据任务大纲*显示成绩单。编码顺序由填充框表示；5′和3′的未翻译区域由开框表示。方框中的分隔符表示内含子。中两个P元素插入的位置*数据任务大纲*指示，以及*数据任务大纲^ΔP*显示删除。图底部的点画条表示用于基因组拯救的DNA片段。*Vha68-1型*编码以相反方向转录的线粒体ATP酶*数据任务大纲*. (B类)野生型和*数据任务大纲*发育126小时的纯合子突变幼虫。野生型幼虫在此时间点的12小时内化蛹，而*数据任务大纲*突变体在幼虫期仍然被抑制，几乎没有或根本没有进一步的生长。(C类)杂合性*数据任务大纲*使幼虫对雷帕霉素敏感。在正常食物中，野生型（黑圈）和*数据任务大纲*/+幼虫（黑钻石）生长速度难以区分。添加1μM雷帕霉素后，野生型（开放圈）的发育延迟了～3天*数据任务大纲*/+幼虫（开口钻石）。

图3
dTOR克隆表型。(*A–C*)损失*数据任务大纲*减少了成虫翅膀中细胞的大小。的克隆年⁻-标记为野生型(A类)或*数据任务大纲^ΔP*(*B、 C类*)通过FLP/FRT介导的有丝分裂重组在幼虫一龄期诱导细胞。包括翼缘刚毛的典型无性系(*A、 B*)和机翼叶片的上皮细胞(C类)如图所示。红色痕迹C类概述了*数据任务大纲^ΔP*突变克隆。每一个毛发状结构都是由单个上皮细胞发出的毛状体。请注意*数据任务大纲*细胞。的基因型*A–C*:*y、 w、HS-FLP¹²²/*+;*数据任务大纲^ΔPFRT40A/Py型*⁺*FRT40A型*. (*D–F型*)的表型*数据任务大纲*增殖过程中的突变细胞。(D类)机翼影像盘共焦图像包含*数据任务大纲^ΔP*用泛素GFP标记的克隆。诱导后72小时，*数据任务大纲^ΔP*突变克隆（用箭头表示；细胞缺乏标记）比野生型双点克隆（用箭表示；细胞携带两份GFP标记）含有更少的细胞。(*E、如果*)翼盘分离细胞的FACS直方图包含*数据任务大纲^ΔP*克隆，如*D.诊断任务大纲^ΔP*细胞和野生型对照细胞分别用重痕迹和轻痕迹表示。缺少细胞*数据任务大纲*减少了前向光散射（FSC）值，表明单元尺寸较小(E类). 人口*数据任务大纲*突变细胞在S和G中的细胞比例也较低₂细胞周期的阶段(F类). 的基因型*D–F型*:*y、 w、HS-FLP¹²²/*+;*数据任务大纲^ΔPFRT40A/Ubi-GFP FRT40A型*.

图4
有丝分裂和内复制细胞周期都需要*数据任务大纲*用Hoechst 33258染色的唾液腺细胞核显示为野生型(*A、 C类*)和*数据任务大纲^ΔP*(*B、天*)在开发的5-6天。(*A–D*)放大倍数相同。(A类)野生型唾液腺的一个～1024 C的单核内复制核。内复制唾液腺细胞核*数据任务大纲^ΔP*幼虫的倍性只有16–32℃(B类). 在野生型中，影像环的增殖二倍体细胞的数量增加了约五倍(C类)比*数据任务大纲^ΔP*(D类)唾液腺。

图5
dTOR作用于dPTEN的下游。缺失等位基因突变的细胞克隆*dPTEN公司*(*A–C*),*数据任务大纲*(*D–F型*)，或*dPTEN公司*和*数据任务大纲*(*G–I型*)由FLP/FRT介导的有丝分裂重组诱导。突变细胞以GFP缺失或年+如图3所示。最左边的柱描绘了流式细胞术分析的翼想象盘细胞直方图；深色痕迹表示突变细胞，浅色痕迹表示来自同一椎间盘的野生型对照细胞。右栏显示了成年翅膀前缘突变克隆的显微照片。损失*dPTEN公司*导致细胞增大(*A、 C类*)增加S和G细胞的比例₂细胞周期的阶段(B类). 损失*数据任务大纲*减小单元格大小(*D、 E类*)并减少S和G₂人口(F类). 缺少细胞*数据任务大纲*和*dPTEN公司*无法与缺乏细胞区分*数据任务大纲*单独(*G–I型*). 基因型：(*A、 B*)*y、 w中，*HS-FLP公司¹²²/+;*dPTEN公司^DJ189型*FRT40A/Ubi-GFP FRT40A；(C类)*y、 w、，*HS-FLP公司¹²²/+;*dPTEN公司^DJ189型*FRT40A/P型年+FRT40A型。(*D、 E类*)*y、 w、，*HS-FLP公司¹²²/+;*数据任务大纲*^ΔPFRT40A/Ubi-GFP FRT40A；(F类)*y、 w、，*HS-FLP型¹²²/+;*数据任务大纲*^ΔPFRT40A/P型年+FRT40A型。(*G、 H（H）*)*y、 w、，*HS-FLP公司¹²²/ +;*数据任务大纲*^ΔP（P）*dPTEN公司^DJ189型*FRT40A/Ubi-GFP FRT40A；(我)*y、 w、，*HS-FLP公司¹²²/+;*数据任务大纲^ΔPdPTEN公司^DJ189型*FRT40A/P型年+FRT40A型。

图6
dTOR与dS6K相互作用。(A类)提取物的免疫印迹*果蝇属*秒₂用HA标记的dS6K转染的细胞，用抗HA抗体显示。dS6K以双链形式迁移，代表磷酸化dS6K的缓慢迁移带（顶部）被雷帕霉素（lane）消除2; Stewart等人，1996年）。当dTOR存在时，dS6K在雷帕霉素存在下保持磷酸化^S1956吨（d任务大纲^右后，车道6)但不是激酶激活型dTOR^S1956吨（d任务大纲^RRKD公司，车道5)与dS6K共转染。(B类)活化人p70的组成性表达^S6K1系列救援*数据任务大纲*飞向生存能力。基因型：（左）*数据任务大纲^第2页UAS-p70型^{S6K1-D4系列}/数据任务大纲^第1页; 行动5c-Gal4/*+; （右）*数据任务大纲^第2页UAS-p70型^{S6K1-D4系列}/CyO；行动5c-Gal4/*+. 注意，获救者*数据任务大纲*fly（左）比控件小。(C类)的构成表达式*dS6K系列*提供雷帕霉素抗性。*无人机-dS6K/*+;*行动5c-Gal4/*+与野生型对照组相比，用1μM雷帕霉素羽化培养的苍蝇提前约3天。

图7
损失*数据任务大纲*模拟饥饿。(*A–C*)包含克隆*数据任务大纲^ΔP*以GFP缺失为标志的细胞(A类)并用抗纤维蛋白染色以突出核仁(B类). dTOR突变克隆的范围用黄色表示。(C类)GFP（绿色）和抗纤维蛋白（红色）的覆盖层。损失*数据任务大纲*导致核仁面积减少。(*D–F型*)正常喂养幼虫的唾液腺（s.g.）和相关脂肪体（f.b.）的差异干涉对比图像(D类)，幼虫被剥夺氨基酸4天(E类)，正常馈电*数据任务大纲*^ΔP幼虫(F类). 饥饿和丧失*数据任务大纲*每一种都会导致脂肪体中脂泡的聚集，以及唾液腺细胞中蛋白质颗粒的积聚。

图8
细胞周期行为*数据任务大纲*细胞。幼虫脑中BrdU掺入模式(*A、 C、E、G*)和唾液腺(*B、 D、F、H*). 深色染色的细胞核表明细胞中含有BrdU，因此在实验期间处于S期。(*A、 B*)野生型，3–4天AED。(*C、 D类*)*数据任务大纲^ΔP*3–4天AED。(*E、 F类*)*数据任务大纲^ΔP*5-6天AED。注意，唾液腺细胞不再包含BrdU，而中枢神经母细胞继续循环。(*G、 H（H）*)*数据任务大纲^ΔP*热休克2小时后，在AED第6–7天携带HS–cyclin E转基因的单个拷贝。细胞周期蛋白E的异位表达驱动静止*数据任务大纲^ΔP*唾液腺细胞进入S期。

图9
细胞周期蛋白E表达减少*数据任务大纲*突变体。(A类)幼虫总提取物的免疫印迹*数据任务大纲^ΔP*和野生型二龄幼虫，用抗细胞周期蛋白E进行检测。用抗β-微管蛋白作为负荷对照进行印迹检测。(*B–D类*)图中显示的是机翼影像盘的一个区域，其中包含*数据任务大纲*^ΔP诱导72小时后克隆，以GFP缺失为标志(B类)并用抗细胞周期素E抗体染色(C类).数据任务大纲突变克隆的轮廓为黄色。这些图像叠加在D类，GFP显示为绿色，cyclin E显示为红色。箭头表示单个*数据任务大纲*表达细胞周期蛋白E的突变细胞；箭头表示*数据任务大纲*缺乏cyclin E表达的克隆。

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