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。2000年10月；11（10）：3509-23。
doi:10.1091/mbc.111.10.3509。

β-catenin的过度表达诱导凋亡，与LEF-1的反式激活功能或主要G1细胞周期调控因子的参与无关

K金 1, K M庞, 马克·埃文思, E D干草
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β-catenin的过度表达诱导凋亡，与LEF-1的反式激活功能或主要G1细胞周期调控因子的参与无关

K金等。 分子生物学细胞。 2000年10月。
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摘要

β-连环蛋白通过与E-cadherin形成细胞表面复合物促进上皮结构，并与细胞核中的TCF/LEF-1相互作用以控制基因表达。通过DNA转染，我们在NIH 3T3成纤维细胞、角膜成纤维细胞，角膜上皮细胞、葡萄膜黑色素瘤细胞和一些癌细胞系中过度表达了β-catenin和/或LEF-1。在所有情况下（有或没有LEF-1），丰富的外源性β-连环蛋白定位于细胞核，并形成与DNA无关的不同核聚集体。令人惊讶的是，我们发现随着时间的推移（转染后5-8天），过度表达β-catenin的细胞都会发生凋亡。LEF-1不需要在场。此外，在缺乏外源性β-连环蛋白的情况下，LEF-1过度表达不会诱导细胞凋亡，即使一些内源性β-连蛋白随外源性LEF-1进入细胞核。TOPFLASH/FOPFLASH报告基因分析表明，全长β-catenin能够诱导LEF-1依赖的反式激活，而Armβ-catening完全消除反式激活功能。然而，含有已知LEF-1转录激活域缺失的臂β-连环蛋白与全长β-连环素具有相同的凋亡作用。过度表达的β-catenin还可诱导仅定位于细胞质的核定位信号缺失LEF-1转染细胞的凋亡。因此，过度表达的外源性β-catenin的凋亡作用并不依赖于其与核LEF-1的反式激活功能。过度表达的含有10个Arm重复序列的delta-catenin仅诱导轻微的凋亡，这表明主要的凋亡效应可能是由于β-catenin和Arm重复片段的特异性结构域所致。p53、Rb、细胞周期蛋白D1或E2F1的缺失不会影响过表达的β-连环蛋白的凋亡作用，但Bcl-x（L）会降低凋亡作用。我们假设过表达β-连环蛋白的细胞在体内凋亡可能是将其从人群中消除的一种生理机制。

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图1
图1
全长（FL）β-catenin的过度表达诱导细胞凋亡。（A） NIH 3T3细胞表达全长β-catenin–BFP（箭头）在TUNEL染色中呈阳性，显示非常凋亡形态缩小。（B） 表达外源性全长β-catenin–GFP具有明亮的Hoechst阳性细胞核（箭头），而大多数GFP-阴性细胞没有（箭头）。（C）Western blot分析表明外源性全长提取的蛋白质在第2天出现β-catenin–GFP/BFP带转染后，但不在第8天（d）DNA片段测试。NIH 3T3细胞转染全长β-catenin后，DNA用DNA梯（1道）和对照组在不同时间提取模拟转染NIH 3T3细胞5天后提取DNA转染（通道2）。DNA片段在第2天开始出现转染β-catenin（lane 3）并在5时增强转染后d（通道4）。棒材，50μm。
图2
图2
全长β-catenin的过度表达诱导细胞凋亡。（A） 全长β-连环蛋白（FLβ-catenin，虚线条）诱导NIH 3T3细胞显著凋亡，但BFP载体（模拟转染），而LEF-1没有。δ-连环蛋白仅诱导轻微细胞凋亡。BFP阳性细胞的总百分比随转染效率。（B） β-catenin过度表达诱导所有人结肠癌中的凋亡（阴影条）。（C） GFP阳性肿瘤细胞过度表达全长β-catenin，很容易转染后2d检测（箭头）。然而，细胞表达全长β-连环蛋白-GFP的细胞明显小于GFP阴性细胞（SW48、HCT116、DLD1和SW480，人类结肠肿瘤；HeLa，人宫颈癌；和M619，人类葡萄膜黑色素瘤）。棒材，50μm。
图3
图3
β-catenin的凋亡作用与LEF-1的交易激活功能无关。（A）NIH 3T3成纤维细胞表达不同的β-catenin结构。全长（FL）、C末端缺失（delC）和臂β-catenin分别为GFP荧光检测主要在细胞核中，在细胞核中形成不同的聚集。N-末端-删除（delN）β-catenin累积主要在细胞质中。GFP，控制空GFP转染。酒吧，50微米。（B） 外源性β-连环蛋白的存在通过抗β-catenin和抗GFP的Western blot分析抗体。外源全长和ΔN1–86β-连环蛋白被这两种方法检测为带（分别为119和110 kDa）抗体。因为抗β-连环蛋白抗体是针对β-catenin中C末端残基（571-781个氨基酸）的免疫原，ΔCβ-连环蛋白（ΔC669–781）和臂β-连环素（ΔN1–86和ΔC669–781）显示非常微弱的条带（分别为108和99 kDa）抗β-catenin抗体。然而，外源ΔC和臂β-连环蛋白被抗GFP抗体明确证实（底部面板）。（C） 全长和ΔNβ-catenin能够进行私人交易TOPFLASH-含有TCF/LEF-1结合基序的Luc报告子，而Armβ-catenin完全取消了反式激活功能。ΔCβ-catenin仅显示边际反式激活（1.3倍）。FOPFLASH公司含有突变结合位点的报告子不被任何β-连环蛋白结构。（D） 臂β-连环蛋白没有任何TCF/LEF-1的反式激活活性，但仍能诱导细胞凋亡。
图4
图4
β-catenin的凋亡作用不是受LEF-1定位的影响。（A） 稳定克隆NIH 3T3细胞过表达全长（FL）LEF-1和NLS缺失的LEF-1已建立。使用后证实外源性LEF-1的定位抗HA抗体。全长外源性LEF-1定位于但很少或没有NLS缺失的LEF-1进入细胞核。（B）这些细胞中外源性全长β-连环蛋白–GFP均进入即使一些细胞过度表达全长LEF-1或NLS删除了LEF-1。（C） 全长β-catenin的过度表达诱导全长或全长过度表达的细胞凋亡NLS删除了LEF-1。（D） 不同β-连环蛋白诱导A23细胞凋亡细胞过度表达全长LEF-1。偶数臂β-catenin，无反式激活结构域能够诱导细胞凋亡。棒材，50μm。
图5
图5
β-catenin和LEF-1的短期激活上调细胞周期蛋白D1而非c-myc。然而，这种上调规定以与时间相关的方式减少。（A） 荧光素酶报告分析cyclin D1启动子。β-连环蛋白（NIH/FL）和LEF-1（A23Con）过度表达增加细胞周期蛋白D1报告活性转染，以及外源性β-连环蛋白和LEF-1的结合（A23FL）。然而，细胞周期蛋白D1的上调维持在仅在A23Con（稳定克隆NIH 3T3细胞）中转染后9天过表达全长LEF-1）或A23FLβ-连环蛋白。臂β-catenin没有反式激活功能，不能上调细胞周期蛋白D1即使在短期激活后（d 2，NIHArm和A23Arm）。NIHCon公司，用GFP空载体转染亲代NIH 3T3细胞。（B）全长β-catenin过度表达诱导细胞周期蛋白凋亡D1缺陷的成纤维细胞。（C） 逆转录聚合酶链反应。三个稳定的克隆（A7、A23、，使用NIH 3T3成纤维细胞。或者，LEF-1的拼接形式为在NIH 3T3成纤维细胞中检测到。然而，没有增加这些克隆细胞中c-myc mRNA与亲代NIH 3T3的比较成纤维细胞。β-肌动蛋白引物用于确认加载。
图6
图6
Rb、E2F1和p53的缺失并不影响β-catenin的凋亡作用。（A） 全长β-catenin–GFP被转染到缺乏每个感兴趣基因的成纤维细胞中（Rβ−/−，E2F1−/−，或第53页−/−). 我们还使用SV40永生化的成纤维细胞野生型大T抗原（Tag WT），可阻断Rb和p53功能。作为对照，我们使用了Rβ阳性的成纤维细胞（卢比+/+)和表达SV40 Tag突变体（MT）的成纤维细胞，它取消了Rb上的阻塞功能。β-连环蛋白–GFP定位在细胞核中呈点状。棒材，50μm。（B） 过度表达β-catenin诱导所有Rb-、E2F1-和p53缺陷的细胞凋亡成纤维细胞和表达SV40 Tag WT的成纤维细胞中，排除了这些基因在β-连环蛋白凋亡途径中的作用。
图7
图7
Bcl-x（L）的过度表达部分抑制β-catenin的凋亡作用。（A） 全长（FL）和臂β-catenin诱导HeLa细胞和HeLa淋巴细胞凋亡Bcl-x（L）过度表达。只有少数单元格（箭头）包含7天Bar，50μm后外源性GFP标记。（B） 这些凋亡的过度表达Bcl-x（L）的HeLa细胞的作用受到抑制。之后转染第7天，亲代HeLa细胞显示很少BFP阳性细胞（过度表达β-catenin），而过表达Bcl-x（L）（HeLa-Bcl）的HeLa细胞仍显示BFP阳性表达全长（FL）或臂β-连环蛋白的细胞。（C）Western blot分析显示全长β-catenin–GFP可以8天后在过度表达Bcl-x（L）的HeLa细胞中仍能检测到转染，尽管转染量低于d2。因为缺乏臂β-连环蛋白的结合表位和类似分子量内源性β-catenin很难区分Arm抗β连环蛋白抗体从内源性β连环素中提取β连环肽（顶部面板）。然而，抗GFP抗体的印迹清楚地显示HeLa第2天的臂β-连环蛋白带和第8天的减少带细胞过度表达Bcl-x（L）。在HeLa中未检测到任何带第8天的亲代细胞。Con，对照HeLa细胞提取物，不含转染；HeLa、HeLa亲本细胞；Bcl-x（L），HeLa细胞Bcl-x（L）过度表达；FL，全长β-catenin转染；应收账。，臂β-catenin转染；恩多。，内源性β-连环蛋白。
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