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.2000年7月；5(3):229-42.
doi:10.1379/1466-1268（2000）005<0229:ptfhwt>2.0.co；2

HSF1在起始前复合体中的潜在靶点

CX元 1, W B格利
附属公司

预引发复合体内HSF1的潜在靶点

CX元等。 细胞应激伴侣. 2000年7月.

摘要

对人类热休克转录因子1（hHSF1）与一般转录因子TFIIA-gamma、TFIIB、TBP、TAF（II）32和TAF（Ⅱ）55以及正辅激活子PC4之间的蛋白质相互作用进行了表征，以确定转录前启动复合体中的潜在接触靶点。这些接触是热应激信号传递到转录装置的最后步骤之一。基于体外相互作用分析，TATA-结合蛋白（TBP）和转录因子IIB（TFIIB）被确定为HSF1转录激活域AD1和AD2的主要靶点。TBP与AD2和含有AD1的片段具有亲和力，而TFIIB的核心结构域主要与AD1片段相互作用。还检测到全长HSF1和TFIIA的小亚基（γ）之间的相互作用。PC4与HSF2的相互作用较弱，与HSF1的亲和力更低。HeLa细胞瞬时表达TBP的免疫共沉淀证明HSF1 AD2和AD1+AD2能够在体内结合TBP。基于转录干扰的分析证实了TBP和TFIIB都可以与HeLa细胞中的HSF1激活域相互作用的预测。HSF1的负调控区（NR）没有与任何体外测试的一般因子相互作用，但通过可能涉及TATA相关蛋白（TAFs）的接触物在核提取物中结合TFIID。这些结果表明HSF1的转录调控模型涉及NR功能失调的TFIID复合物和C末端激活域的转录活性复合物之间的转换。

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数字

图1。
图1。
一般转录因子与人HSF1的体外相互作用。（A） 固定化GST-HSF1与TBP、TFIIB、TFIIA-γ、TAF之间相互作用的图解总结二32岁，TAF二55和PC4。加号（+）对应于蛋白质印迹带的强度（面板B–F）。空白表示未对相互作用进行测试。阳性对照组和阴性对照组被指定为C1到C4，分别代表仅含有GST、VP16突变体（Δ456-FP442）、非突变VP16（aa 413–490）和酵母TBP N末端（scTBP，aa 1–82）的构建物。构装物编号是指面板B至F中所示的Western blot上的车道。所有转录因子均表达于大肠杆菌并且在N末端含有T7表位。所有的结合反应都是用等量的原油进行的大肠杆菌除非另有说明，否则在150 mM KCl下含有全长重组因子的提取物。（B） 在150和300 mM KCl下与人TBP的相互作用。对于全长GST-HSF1，大约80%的输入TBP在这些条件下绑定。（C） 与TFIIB的互动。在这些条件下，大约50%的输入TFIIB被绑定。（D） 与TFIIA-γ的相互作用。（E） 与TAF的互动二32（顶部）和TAF二55（底部）。（F） 与正辅活化子PC4的相互作用。用TFIIB和PC4检测人HSF2（H2）。输入（Ip）通道包含结合分析中总含量的10%。DBD，DNA-结合域；A和B，寡聚结构域的疏水区域A和B（HR-A和HR-B）；NR，负域；AD1和AD2，激活域1和2
图2。
图2。
体外与HSF1 AD1+2相互作用的TBP区域。（A） TBP和AD1+AD2之间相互作用的图表总结。GST融合蛋白（TBP或HSF1 AD1+2）固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖珠上，以及来自大肠杆菌或者在转化的HeLa细胞的核提取物中。提取物中的配体蛋白在N端用T7表位进行标记。阴影区域对应于与HSF1相互作用的TBP序列。R1和R2表示保守核心的重复序列。（B） AD1+2蛋白的Western blot大肠杆菌提取物与固定化GST-TBP融合蛋白结合，对应于面板A中描述的TBP缺失。（C）TBP缺失与GST-AD1+2结合的蛋白质印迹。TBP删除大肠杆菌裂解产物用于与固定化GST-AD1+2融合蛋白的结合反应。（D） TBP缺失与GST-AD1+2结合的Western blot。利用转化的HeLa细胞裂解液中的TBP缺失与GST-AD1+2融合蛋白相互作用，并用抗T7标记抗体检测。条形图表示代表已删除TBP蛋白的预期条带位置。泳道数对应于图A中的TBP构建体。所有图中的泳道C代表阴性对照，显示全长TBP（配体）和固定化GST之间的非特异性相互作用量
图3。
图3。
TFIIB在体外与HSF1 AD1+2相互作用的区域。所有蛋白质均表达于大肠杆菌，并且在每个结合反应中添加大约等量的每个TFIIB结构。GST-AD1+2融合蛋白固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖微球上，野生型和截短型TFIIB蛋白（配体）被T7表位标记。（A） 与代表TFIIB各种截断的示意图的交互摘要。显示了保守核心的重复域（R1和R2）。（B） 蛋白印迹显示TFIIB结构体1至6在150 mM或250 mM KCl下的相互作用。车道编号对应于面板A中描述的TFIIB截断。车道C代表阴性对照，显示全长TBP（配体）和固定化GST之间的非特异性相互作用
图4。
图4。
HeLa全细胞提取物中的天然TFIID复合物在体外结合固定化HSF1 C末端活化域。（A） 结合GST-AD2的全细胞提取物瞬时表达TBP（T7-tagged）的Western blot。（B） HeLa全细胞提取物内源性TBP与GST-AD2和GST-AD1+2结合的Western blot。50微升全细胞提取物和20微升GST-AD1+2用于所示盐浓度下的结合分析。用抗T7表位单克隆抗体或抗hTBP观察TBP。车道：C=GST阴性对照；Ip=输入量；2=AD2；1+2=AD1+2；M=由大肠杆菌中表达的T7标记TBP组成的标记。
图5。
图5。
TBP与HSF1的相互作用通过共免疫沉淀证实。用T7-标记的TBP与HeLa细胞共表达的嵌合蛋白GAL4-AD2、GAL4-AD1+2或GAL4-AD2（MA-1）共免疫沉淀。加号（+）表示转染混合物中每个质粒的存在。AD2（MA-1）构建体含有突变的AD2，当在酵母细胞中检测时，其转录活性严重受损（Yuan等人，1997）。蛋白质复合物首先使用与蛋白A-Sepharose珠共价交联的抗GAL4 DBD抗体进行免疫沉淀。然后用抗T7标记抗体检测Western blot检测复合物中是否存在T7标记的TBP
图6。
图6。
HeLa核提取物中HSF1负区结合TFIID。用热应激（HS+）和非热应激（−）细胞制备的核提取物（500μL）在100 mM KCl中与固定化GST和GST-阴性区域融合蛋白（GST-NR）进行结合反应。GST-NR构建体包含hHSF1的aa 212至310的区域。通过用抗TBP抗体探测印迹蛋白来观察TBP
图7。
图7。
通过转录干扰试验分析AD1+2和TBP之间的体内相互作用。（A） 示意图显示全长和截短的T7标记TBP蛋白与GAL4-AD1+2共表达。（B） T7标记的TBP突变体在HeLa细胞中瞬时表达并用抗T7标记抗体检测的Western blot。数字表明面板A中描述的结构。（C）转录干扰试验表明共表达TBP突变体对AD1+2转录活性的影响。一个包含HSF1激活域AD1+2的效应质粒与载体pNG-SB中的GAL4 DBD融合。另一个效应质粒由T7-tag的TBP缺失和克隆到载体pT7-NLS中的核定位信号组成。报告者是TATA-box（pG5luc）上游具有5个GAL4 DNA结合位点的荧光素酶基因。标记为“C”的车道包含pCI-neo，作为一种空载体控制，仅在CMV启动子下游有多聚体。将以下DNA共转染到HeLa细胞中：0.3μg GAL4-AD1+2、3μg TBP突变体、2μg pG5luc和0.5μg生长激素报告物（pXGH5）作为内标物。对于所有分析，三次转染的荧光素酶活性根据人类生长激素的产生进行标准化，以建立相对活性。pCI-neo单独的活性值为100%。（D） 转录干扰试验表明TBP突变体对VP16的转录活性影响不大。使用哺乳动物双杂交系统监测VP16活性，通过GAL4 DBD-P和N-VP16载体的共表达重建VP16活性（Patel等人1995年）。TBP突变体的共表达和空载体控制如面板C中所述。转染中VP16效应器与TBP突变DNA的比率为1:10。仅VP16效应器的活性被指定为100%。GAL4-HSFAD1+2的活性是2杂交GAL4-VP16活性的0.39倍
图8。
图8。
通过转录干扰试验分析AD1+2和TFIIB之间的体内相互作用。（A） TFIIB和突变蛋白图。星号表示hTFIIB的E1螺旋中有2个点突变：R185到E185和R193到E193。（B） T7标记的TFIIB突变体在HeLa细胞中瞬时表达并用抗T7标记抗体检测的Western blot。（C） 野生型和突变的TFIIB1-207缺失对GAL4-AD1+2活性的抑制。在转化过程中，第一个效应器是载体pNG-SB中的GAL4-AD1+2融合，第二个效应器为载体pT7-NLS中带有T7表位标签和核定位信号的TFIIB缺失片段。荧光素酶报告质粒为pG5luc，来自pCI-neo的DNA用作空载体控制（通道C）。共转染的DNA如下：0.3μg GAL4-AD1+2、3μg TFIIB突变体、2μg荧光素酶报告子（pG5luc）和0.5μg生长激素报告子（pXGH5）。使用人类生长激素表达标准化三次检测的荧光素酶活性
图9。
图9。
通过转录干扰试验分析GAL4-AD1+2和PC4之间的体内相互作用。（A） PC4构造示意图。（B） PC4突变蛋白共表达抑制GAL4-AD1+2活性的试验。效应质粒由载体pNG-SB和PC4中GAL4-AD1+2与载体pT7-NLS中的T7-tag和核定位信号融合而成。荧光素酶报告质粒为pG5luc，来自pCI-neo的DNA用作空载体控制（通道C）。车道编号对应于结构名称。共转染DNA：0.3μg GAL4-AD1+2，3μg PC4突变体，2μg萤光素酶报告基因（pG5luc）和0.5μg生长激素报告基因（pXGH5）。每个转染的荧光素酶活性通过人类生长激素表达进行标准化。（C） PC4蛋白表达的Western blot。PC4突变蛋白在HeLa细胞中瞬时表达，并用抗T7标签抗体检测
图10。
图10。
负调控区在控制HSF1转录活性中的作用模型。负调控区（NR）与未知TAF结合二s（TAF二十） 在基础和热冲击条件下，在TFIID内。（A） 受限访问模型。用水杨酸钠等抗炎剂处理细胞后，HSF1与HS基因的启动子结合。NR的构象限制了hHSF1（AD1和AD2）的C末端活化域与TBP的有效接触。暂停RNA聚合酶II的H结构域与TBP相互作用。热冲击后，NR呈现出允许AD1和AD2与TBP接触的构象。H结构域移位，延伸和再初始化继续进行。（B） TFIID畸变模型。活化剂对TBP的接触由TAF决定，TAF在非热冲击条件下（例如水杨酸盐处理）与NR接触时会掩盖TBP。NR在从基础状态到热冲击状态的转变过程中发生构象变化。在非热冲击条件下，NR与TFIID接触，导致TBP无法与活化域接触。在热冲击下，NR构象的改变使其与TFIID接触，不会导致TBP掩蔽。TAF被指定为X、Y和Z。其他蛋白质或HSF1修饰在NR活性和非活性构象形成中的作用尚不清楚
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