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.2000年10月；20(20):7685-92.
doi:10.1128/MCB.20.20.7685-7692.2000。

内皮细胞定位和受体动力学决定肝细胞生长因子调节酪氨酸激酶底物的酪氨酸磷酸化

S Urbé 1, I G Mills公司, H斯坦马克, 北村N号, M J克拉格
附属公司

内皮细胞定位和受体动力学决定肝细胞生长因子调节酪氨酸激酶底物的酪氨酸磷酸化

S Urbé等。 分子细胞生物学. 2000年10月.

摘要

肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物（Hrs）是活化酪氨酸激酶受体的一种重要底物，被认为在胞内膜转运中发挥作用。该蛋白含有一个FYVE结构域，该结构域与磷脂酰肌醇（PI）3-磷酸（PI 3-P）特异性结合。我们表明，这种相互作用是蛋白质正确定位到仅部分与早期内胚体自身抗原1一致的内胚体所必需的，也是蛋白质对表皮生长因子刺激的有效酪氨酸磷酸化所必需的。用沃特曼素治疗表明，Hrs磷酸化还需要PI3-激酶活性，这是产生定位所需的PI3-P所必需的。我们使用高渗介质和主要阴性形式的动力蛋白（K44A）的表达来抑制内吞作用；在何种条件下，受体刺激不能诱导Hrs磷酸化。我们的结果提供了一个信号转导途径与内吞作用耦合的明确例子，从中我们提出激活受体（或相关因子）必须输送到适当的内吞区室，才能发生Hrs磷酸化。

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图1
图1
Hrs-HA的免疫定位。用Hrs-HA转染HeLa细胞，并在转染后22（A、C、D、E和F）或40（B）h进行免疫荧光处理。这些细胞要么在固定前被皂苷渗透（A、B、D和F），要么立即固定并用Triton X-100（C和E）渗透，并与抗HA（以红色显示）和抗EEA1（A和B）、抗M6PR（D）或抗CD63（E）（均以绿色显示）共染。在固定之前，用生物素化转铁蛋白（25μg/ml，在Dulbecco改良的Eagle培养基中）培养15分钟，并与Oregon Green 488标记的链霉亲和素共染。F组显示的细胞也与GFP-NAGTI共转染。所有面板都显示了以260-nm间隔拍摄的Z系列的合成。在表达大量Hrs的细胞中明显可见大小体，在转染后较长时间内更为常见（B），但在早期的少数细胞中也可见（E和F）。这些结构包含EEA1（B）、M6PR和转铁蛋白受体（数据未显示），但不包括溶酶体和高尔基体标记物（E和F）。
图2
图2
Hrs的FYVE域突变体不与EEA1共定位。HeLa细胞转染Hrs-HA（A到C）、C215S-HA（D到F）、ΔZF-HA（G到I）或C190/215S-HA（J到L），并在转染后22 h进行免疫荧光处理。细胞在固定前被皂苷渗透，以突出颗粒结构（A至F），或立即固定并用Triton X-100（G至L）渗透，并与抗HA（红色显示）和抗EEA1（绿色显示）共存。插图（a至F）中用星形表示的区域被放大。所有面板都显示一个共焦截面。
图3
图3
PI3-激酶活性和完整的FYVE结构域对EGF-依赖的Hrs酪氨酸磷酸化是必需的。（A）膜结合的沃特曼敏感性。（左）从HeLa和BHK细胞中制备膜组分，这些细胞在含有（+）或不含（−）100 nM沃特曼（Wort）的情况下预培养15分钟。（右）如Gorvel等人（9）所述，通过浮选梯度分离，从BHK细胞中制备富含早期内体（EE）的组分，BHK细胞用（+）或不加（-）100 nM沃特曼预处理15分钟。在每种情况下，用SDS–12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析10μg蛋白质，然后转移到硝酸纤维素中并用抗Hrs抗体进行印迹。（B） Hrs磷酸化对沃特曼敏感。将未转染或Hrs-HA转染的HeLa细胞在无血清培养基中饥饿16 h，然后在转染后用（+）或不使用（−）沃特曼蛋白预培养22 h 15 min，并用EGF（100 ng/ml）和（+）或者不使用（–）沃特曼宁（100 nM）刺激8 min。从未转染细胞和转染细胞制备裂解物，并分别用抗Hrs或抗HA抗体进行免疫沉淀。用PY20抗体通过免疫印迹法评估磷酸化。显示分子量标记。（C和D）高效Hrs磷酸化需要完整的FYVE结构域。（C） 用Hrs-HA、ΔZF-HA、Y197F-HA、Y216F-HA、C215S-HA、C190S-HA或C190/215S-HA转染HeLa细胞。实验前，细胞饥饿12小时。在转染后22小时用100ng/ml的EGF刺激细胞，然后裂解，并按照材料和方法中所述进行处理。用抗HA抗体对裂解产物进行免疫沉淀，用PY20抗体对免疫沉淀蛋白进行免疫印迹分析。通过免疫印迹25μg溶血物和抗HA抗体比较不同突变体的表达水平（底部）。收集实验的定量(n个≥3，对于每个突变体）如面板D所示。FYVE结构域的突变将磷酸化降低到与沃特曼蛋白（Hrs+Wrt，n个= 4).
图4
图4
内化EGF与Hrs-HA共定位，但不与C190S-HA共定位。用Hrs-HA（A至I）或C190S-HA（J至L）转染HeLa细胞，并在无血清培养基中饥饿12 h。生物素化EGF（50 ng/ml）内化8 min，用PFA固定细胞并进行免疫荧光处理。细胞被标记为抗HA抗体，然后是德克萨斯州红偶联二级抗体（a、D、G和J；覆盖物中为红色）。用链霉亲和素结合俄勒冈州绿488（B、E、H和K；覆盖层为绿色）标记内部EGF。面板A至C、D至F和G至I显示了以260-nm间隔拍摄的三个连续截面。请注意单个通道中HA和EGF的相应标记模式（第一列和第二列）。箭头用于突出显示与两个标签相关的puntae示例。在面板D至F中，以较高的放大率显示了由方框包围的双标穿孔星座。面板J至L显示一个共焦截面。
图5
图5
Hrs的EGF-依赖性酪氨酸磷酸化需要氯菊酯介导的内吞作用。（A）HeLa细胞在无血清培养基中饥饿16小时，在缺乏（Con.）或存在（Hyp[高渗培养基]）450 mM蔗糖的情况下，用（+）或不含（−）EGF（100 ng/ml）刺激8分钟。细胞被裂解，蛋白被抗Hrs抗体免疫沉淀。免疫沉淀蛋白和总蛋白（裂解物）用PY20抗体进行免疫印迹分析。（B） 通过四环素脱毒（−Tet）诱导稳定转染的K44A细胞（+Tet）表达显性阴性dynamin突变体。然后将细胞在无血清培养基中饥饿16 h，用EGF（100 ng/ml）刺激8 min，然后溶解。用抗Hrs抗体免疫沉淀的酪氨酸磷酸化蛋白和来自三次重复实验的总蛋白按照面板A的图例所述进行分析。在没有EGF的情况下，没有磷酸化酪氨酸信号免疫沉淀（数据未显示）。在面板A和B中显示的结果中，略低于198-kDa标记的裂解物中的酪氨酸磷酸化带对应于EGF受体，并且在没有氯氰菊酯介导的内吞作用的情况下降低。
图6
图6
磷酸化小时主要是细胞溶质。将HeLa细胞在无血清培养基中饥饿16 h，并用每ml 100 ng EGF刺激8 min。按照材料和方法中的描述制备核后上清液（P）、膜（M）和胞浆（C）。然后用抗Hrs抗体对等量的蛋白质进行免疫沉淀，并用PY20抗体（顶部）或抗Hrs（底部）进行免疫印迹分析。指示分子量标记（预处理）。
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