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.2000年10月；74(19):8953-65.
doi:10.1128/jvi.74.19.8953-8965.2000。

脊髓灰质炎病毒感染和单个病毒蛋白重塑内质网：病毒诱导小泡的自噬样来源

D A Suhy公司 1, T H Giddings Jr公司, K Kirkegaard公司
附属公司

脊髓灰质炎病毒感染和单个病毒蛋白重塑内质网：病毒诱导的囊泡的自噬样起源

D A Suhy公司等。 J维罗尔. 2000年10月.

摘要

真核生物的所有阳性RNA病毒研究在细胞质膜表面组装RNA复制复合物。哺乳动物细胞感染脊髓灰质炎病毒和其他小核糖核酸病毒会导致细胞膜急剧重排和泡状堆积。脊髓灰质炎病毒诱导的膜与内质网（ER）、溶酶体、线粒体或大多数高尔基衍生膜或内质膜在浮力密度梯度上没有共分馏，尽管离子强度的变化同样影响内质网和病毒诱导的小泡，但不影响其他细胞器。当分离表达时，脊髓灰质炎病毒RNA复制复合物的两种病毒蛋白3A和2C与内质网膜共分离。然而，在表达2BC（2B和2C蛋白的蛋白水解前体）的细胞中，形成了与脊髓灰质炎病毒感染期间观察到的具有相同浮力密度的膜。当与2BC共表达时，病毒蛋白3A定量地并入这些组分中，形成的膜与脊髓灰质炎病毒感染细胞的膜在超微结构上相似。这些数据表明，脊髓灰质炎病毒诱导的小泡是通过病毒蛋白2BC和3A的作用，通过排除宿主蛋白的机制从内质网中衍生出来的。脊髓灰质炎病毒诱导的细胞膜的双膜形态、胞质含量和明显的内质网来源均与这些细胞膜的自噬来源一致。

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图1
图1
高压冷冻保存的COS-1细胞的电镜照片显示了未感染细胞和感染脊髓灰质炎病毒4小时后细胞的超微结构。（A） 未感染细胞。N、 细胞核；G、 高尔基。棒材=1μm。（B） 感染细胞；bar=1μm。（C） 感染细胞；巴=0.2μm。（D） 使用与二级抗体结合的15-nm金颗粒对感染细胞进行免疫染色，以识别脊髓灰质炎病毒2C表位。箭头表示双膜囊泡。棒材=0.3μm。
图2
图2
未感染和脊髓灰质炎病毒感染细胞亚细胞膜分布的密度梯度分析。脊髓灰质炎病毒感染4小时后，COS-1细胞的质膜被破坏，细胞质细胞器在Percoll密度梯度上分离。收集单个组分（最轻组分位于左侧），测试酶活性或通过免疫印迹分析鉴定脊髓灰质炎病毒2C蛋白（A、B和C）、ER标记物p63（A）、高尔基体标记物p115（B）和mtHSP70[HSP70m（mito）]（C）。β-己糖胺酶活性测定用于鉴定来自溶酶体的组分[β-Hex（Lyso）]（C）。库存等渗Percoll浓度分别为20%（A）和9.5%（B和C）。
图3
图3
表达脊髓灰质炎病毒3A蛋白的COS-1细胞的密度梯度和超微结构分析。（A） 表达3A蛋白的细胞的细胞质膜在12%的原液等渗Percoll上分离；使用针对脊髓灰质炎病毒3A蛋白、calnexin（ER）和mtHSP70[HSP70m（mito）；线粒体]；最轻的分数在左边。高尔基体和溶酶体蛋白的分布图与图中显示的模式没有显著差异。2为了简单起见，没有包括在内。（B） 表达脊髓灰质炎病毒3A蛋白的COS-1细胞的超微结构。N、 核心。棒材=1μm。
图4
图4
表达脊髓灰质炎病毒蛋白2C和3A的COS-1细胞的密度梯度和超微结构分析。（A） 表达2C和3A蛋白的细胞的细胞质膜在12%的原液等渗Percoll梯度上分离；使用针对脊髓灰质炎病毒2C、脊髓灰质病毒3A、calnexin（ER）和mtHSP70（HSP70m（mito）线粒体）的抗体通过免疫印迹法检测每个组分中的蛋白质；最轻的分数在左边。（B） 电子显微镜显示2C和3A表达对COS-1细胞超微结构的影响。N、 核心。棒材=1μm。（C） 用与第二抗体偶联的15nm金颗粒标记的切片。主要抗体针对脊髓灰质炎病毒蛋白2C。棒材=0.5μm。
图5
图5
表达脊髓灰质炎病毒2BC蛋白的COS-1细胞的密度梯度和超微结构分析。（A） 表达2BC蛋白的细胞的细胞质膜在12%的原液等渗Percoll梯度上分离；使用针对脊髓灰质炎病毒2C、calnexin（ER）和mtHSP70（HSP70m（mito）线粒体）的抗体通过免疫印迹法检测每个组分中的蛋白质；最轻的分数在左边。（B） 转染2BC-表达质粒的COS-1细胞的超微结构。G、 高尔基。棒材=2μm。（C） 使用抗2C抗体和与15-nm金颗粒偶联的二级抗体的免疫染色切片。棒材=0.5μm。
图6
图6
与编码脊髓灰质炎病毒2BC和3A蛋白的质粒共同转染的COS-1细胞的密度梯度和超微结构分析。（A） 表达2BC和3A蛋白的细胞的细胞质膜在12%的原液等渗Percoll梯度上分离；使用针对脊髓灰质炎病毒2C、脊髓灰质病毒3A、calnexin（ER）和mtHSP70（HSP70m（mito）线粒体）的抗体通过免疫印迹法检测每个组分中的蛋白质；最轻的分数在左边。（B） 转染2BC-和3A-表达质粒的COS-1细胞的超微结构。N、 核心。棒材=1μm。（C） 2BC和3A转染细胞的切片的高分辨率图像。棒材=0.2μm。（D） 一种2BC-和3A转染的细胞，用针对2C蛋白的抗体进行免疫染色。次级抗体与15纳米金颗粒偶联。箭头表示双膜囊泡。棒材=0.5μm。
图7
图7
离子强度增加对细胞膜和脊髓灰质炎病毒诱导的囊泡的影响。在感染野生型脊髓灰质炎病毒4小时后，COS-1细胞的质膜在均质缓冲液中被破坏，细胞器在12%的储备等渗Percoll密度梯度上分离，该梯度不含（a和C）或（B和D）不含60 mM KCl；最轻的分数在左边。（A和B）如图所示，通过免疫印迹法确定内质网膜和脊髓灰质炎病毒诱导的小泡的分布。（C和D）如图所示，通过针对p115的免疫印迹、针对mtHSP70的免疫印记[HSP70m（mito）和β-己糖胺酶（β-Hex）分析确定高尔基体、线粒体和溶酶体（Lyso）膜的分布。
图8
图8
离子强度增加对内体和脊髓灰质炎病毒诱导的囊泡的浮力密度分布的影响。在感染脊髓灰质炎病毒4小时后，在存在和不存在60 mM KCl的均质缓冲液中，COS-1细胞的质膜被破坏，细胞器在12%的储备等渗Percoll密度梯度上分离，该密度梯度不包含或包含60 mM的KCl；最轻的分数在左边。（A） 在存在和不存在60 mM KCl的情况下，含有Rab9的膜的分布；（B） 60 mM KCl存在和不存在时含脊髓灰质炎病毒2C膜的分布。
图9
图9
脊髓灰质炎病毒诱导的囊泡形成模型。脊髓灰质炎病毒复制复合体的蛋白质，特别是2BC和3A（开放的方形和圆形），在内质网上的斑块中积累。双层小泡通过一种机制从内质网膜中衍生出来，这种机制排除细胞膜蛋白质（封闭的方形和环形），但在内腔中包括细胞质物质（黑色）。
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参考文献

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