Subcellular localization of wild-type and Parkinson's disease-associated mutant alpha -synuclein in human and transgenic mouse brain

doi:10.1523/JNEUROSCI.20-17-06365.2000

.2000年9月1日；20(17):6365-73.

doi:10.1523/JNEUROSCI.20-17-06365.2000。

野生型和帕金森病相关突变体α-突触核蛋白在人和转基因小鼠脑中的亚细胞定位

P J Kahle先生¹, M诺依曼, L Ozmen公司, V穆勒, H雅各布森, 辛齐洛兹, M Okochi先生, U Leimer公司, H van Der Putten公司, 探险家, E克雷默, H A Kretzschmar先生, C哈斯

附属公司

PMID： 10964942
预防性维修识别码：项目经理6772969
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.20-17-06365.2000

野生型和帕金森病相关突变体α-突触核蛋白在人和转基因小鼠脑中的亚细胞定位

P J Kahle先生等。神经科学. 2000.

.2000年9月1日；20(17):6365-73.

doi:10.1523/JNEUROSCI.20-17-06365.2000。

作者

P J Kahle先生¹, M诺依曼, L Ozmen（奥兹曼）, V穆勒, H雅各布森, 辛齐洛兹, M Okochi先生, U Leimer公司, 范德普滕, 探险家, E克雷默, H A Kretzschmar先生, C哈斯

附属

¹德国慕尼黑80336路德维希·马克西米利安大学生物化学系阿道夫·布特南特研究所。pkahle@pbm.med.uni-muenchen.de

PMID： 10964942
预防性维修识别码：第6772969页
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.20-17-06365.2000

摘要

alpha-synuclein（alphaSYN）基因突变与罕见的家族性帕金森病相关，alphaSYN是路易体和路易神经节的主要成分。在这里，我们研究了野生型和突变型[A30P]αSYN以及βSYN在细胞和亚细胞水平的定位。我们的直接比较研究表明，alphaSYN和betaSYN在人类和小鼠大脑中广泛的突触共定位。在蔗糖梯度平衡离心分析中，一部分betaSYN漂浮到低密度组分中，其中也包含突触囊泡标记突触素。同样，在浮动分数中发现了野生型和[A30P]alphaSYN。小鼠大脑的亚细胞分离显示，突触体中同时存在alphaSYN和betaSYN。与突触体素相反，突触体溶解后，从可溶部分中回收了βSYN和αSYN。通过双染色人脑切片的共焦显微镜直接观察到alphaSYN和betaSYN的突触共定位。帕金森病相关人类突变体[A30P]alphaSYN被发现与转基因小鼠大脑突触中的betaSYN和突触素共定位。然而，除了正常的突触前定位外，转基因野生型和[A30P]αSYN异常积聚在整个大脑的神经元细胞体和神经突中。因此，突变体[A30P]alphaSYN并非不能被转运到突触，但其转基因过度表达明显导致异常细胞积聚。

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数字

**图1。**
选择性检测αSYN和βSYN。A类用6485抗血清对5μg纯化人脑αSYN和βSYN制备的Western blot进行检测(左边)然后剥离并重新接种抗血清6482(*正确的*). 抗血清6485特异性识别βSYN，而针对αSYN C端的抗血清6482对βSYN具有一定的交叉反应性。预处理分子量标记的位置指示给左边每个污点。B类，Western blot由5μg制备(*顶部2个面板*)或2μg(*底部3个面板*)纯化的重组人αSYN、βSYN和γSYN。C类、小鼠耐热上清液(亩)或人类(*嗡嗡声*)将脑细胞液（100μg）冻干并进行15%SDS-PAGE。用针对*正确的*.

**图2。**
脑内同核蛋白的亚细胞定位。直接用200μl小鼠核后上清液进行蔗糖梯度（20–48%）浮选试验(A类)16000×克离心作用(C类). 通过SDS-PAGE（12.5%）分离级分，并依次检测蛋白质印迹中的αSYN(*顶部面板*)，βSYN(*中间面板*)和突触素(底板). 另外两个实验显示了相同的结果。B类采用脑叶切除术后癫痫患者快速处理的颞皮质灰质的核后上清液进行蔗糖梯度（30–48%）漂浮试验。对组分进行Tris–tricine-PAGE（4–20%梯度），并用Mc42抗αSYN连续检测Western blot(*顶部面板*)和抗突触素(底板). ECL用作化学发光底物。另一名患者的组织也显示出同样的结果。D类，亚细胞分离步骤示意图。一只小鼠大脑的核后上清液(E类)（代表3个独立实验）或癫痫患者的颞叶皮层灰质活检(F类)被亚细胞分离。用50μg（只有25μg的突触体颗粒P2可用）进行SDS-PAGE（12.5%）(E类)或20μg（只有10μg的突触囊泡颗粒LP2可用）(F类)每个分数。相应的Western blot被连续检测αSYN(*顶部面板*; Mc42英寸E类，15G7英寸F类)，βSYN(*中间面板*)和突触素(*底部面板*). ECLplus用作化学发光底物F类.

**图3。**
人小脑中αSYN和βSYN的克隆化。抗体15G7抗αSYN(A类)，6485抗βSYN(B类)和抗突触素(C类)在分子层上都染上了点状图案。颗粒细胞层的免疫反应呈斑块状分布，与小脑肾小球的标记相对应。比例尺：*A–C*，100μm。双标记免疫荧光共聚焦显微镜显示αSYN共定位(D类)和βSYN(E类)颗粒细胞层的小脑肾小球导致*黄色的*叠加数字图像中的信号(F类). 突触素也有类似的共定位作用(*G公司*)和βSYN(*H（H）*).我，叠加数字图像。比例尺：*D–I型*，10微米。

**图4。**
[A30P]αSYN在转基因小鼠脑中的表达。A类，转基因结构示意图（未按比例绘制）。*带阴影的盒子*，mThy-1.2启动子区。*打开箱子*Thy-1外显子序列；（截短的）外显子IV包含多聚腺苷酸化信号。实线，Thy-1内含子A.人[A30P]αSYN开放阅读框的启动和终止密码子(*填充的框*; *, A30P突变位点）直接位于*Xho公司*I限制站点(*X（X）*).虚线Thy-1基因的3′-区。N个,不是I限制位点用于在微注射之前线性化构建和删除矢量序列。B类将两种人类αSYN转基因特异探针和一种小鼠β-actin基因探针的混合物杂交到poly（A⁺)如图所示，来自[A30P]αSYN小鼠的RNA。转录本的大小分别为～1.8 kb和2.1 kb。*C–E类*，对所示[A30P]αSYN小鼠系6至10周龄个体的全脑胞质溶胶（200μg）的冷冻热稳定上清液进行15%SDS-PAGE。转移后凝胶的亮蓝染色证明负载量相等。用小鼠特异性抗血清7544连续检测蛋白质印迹(C类)、Mc42(D类)和人类特异性抗体3400(E类). 通过密度扫描量化色带(*底部面板*). 该数据代表了筛选[A30P]αSYN蛋白表达的每条线至少三只动物。αSYN免疫反应双带(星号)在可变强度下观察到与29kDa标准相一致的位置，该位置与二聚体的分子质量一致。这些假定的二聚体物种可以在大凝胶中很好地溶解（P10DS；猫头鹰分离系统，新罕布什尔州朴茨茅斯）(F类). 来自10个月龄18系小鼠的全脑细胞液（600μg）直接接受15%SDS-PAGE，无需任何浓缩步骤。用3400抗体进行Western blot检测。

**图5。**
[A30P]αSYN在转基因小鼠脑中的突触体定位。如图2所示，处理4个月龄雄性18系小鼠的核后上清液A类.用抗血清3400连续检测Western blot(*顶部面板*)、Mc42(*中间面板*)和抗突触素(底板).

**图6。**
转基因和内源性αSYN在小脑切片中的分布。人特异性抗体15G7与非转基因小鼠小脑切片无反应(A类)但在[wt]αSYN小鼠中显示出强烈的分子层标记(B类)和31行[A30P]αSYN(C类)老鼠。此外，在两种转基因小鼠的Purkinje细胞中均观察到弥漫性胞浆免疫反应。小鼠特异性抗血清7544在人类小脑切片中没有显示特异性信号(D类). 在[wt]αSYN小鼠中观察到内源性αSYN的正常突触染色模式，标记分子层和小脑肾小球(E类)和第31行[A30P]αSYN小鼠(F类). 注意，在转基因小鼠中未观察到抗血清7544的细胞溶质染色。

**图7。**
人类αSYN在转基因小鼠脑神经元细胞体和神经突中的积累。在包括额叶皮层在内的大多数大脑区域的细胞体和球突中检测到人类[A30P]αSYN的异常积聚[A类（第31行）和B类（第18行），15G7]。一些[A30P]αSYN填充的神经突起(箭头)由神经元细胞体产生，累积[A30P]αSYN(A类,B类). 相反，βSYN的表达(C类，抗血清6485）和内源性αSYN(D类，抗血清7544）仅限于neuropil，在积聚[A30P]αSYN的神经元细胞体和轴突中未发现。病理性球状αSYN阳性神经炎(箭头)也可以在[wt]的齿状核中观察到(E类)和[A30P][第31行(F类)和第18行(*G公司*);箭头]小鼠（15G7染色）。*H（H）*路易神经节(箭头)LB痴呆患者海马CA2/3区15G7染色。

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1. Abeliovich A、Schmitz Y、Fariñas I、Choi-Lundberg D、Ho W-H、Castillo PE、Shinsky N、Garcia Verdugo JM、Armanini M、Ryan A、Hynes M、Phillips H、Sulzer D、Rosenthal A。缺乏α-突触核蛋白的小鼠显示黑质纹状体多巴胺系统功能缺陷。神经元。2000;25:239–252.-公共医学
1. Arawaka S、Saito Y、Murayama S、Mori H.Lewy小体在伴有脑铁蓄积的神经变性1型中对α-突触核蛋白呈免疫反应。神经病学。1998;51:887–889.-公共医学
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