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。2000年6月15日；19(12):3090-9.
doi:10.1093/emboj/19.12.3090。

哺乳动物RAD51双链断裂修复的非致死显性负形式表征

S兰伯特 1, B S洛佩兹
附属公司

哺乳动物RAD51双链断裂修复的非致死显性负形式表征

S兰伯特等。 欧洲工商管理硕士J。 。

摘要

与酵母RAD51相比，哺乳动物mRAD51是一种必需基因。其在双链断裂（DSB）修复中的作用及其对细胞活力的影响仍有待精确描述。这里，我们使用了一个携带串联重复序列的仓鼠细胞系，其I-SCE:I裂解位点。我们将I-SCE后的保守重组描述为基因转换或染色质内交叉，与切除的互惠产物的随机重新融合相关。我们确定了两种主要的负RAD51形式，它们能特异性抑制保守重组：酵母ScRAD51或酵母-小鼠嵌合体SMRAD51。相反，小鼠MmRAD51刺激保守重组。这些RAD51形式均不影响非保守重组或全局DSB愈合。一贯地，尽管γ射线抗性未受影响，但MmRAD51刺激而ScRAD51或SMRAD51阻止辐射诱导的重组。这表明mRAD51不会显著影响全局DSB修复效率，而是控制重组事件的类别。最后，ScRAD51和SMRAD51均显著抑制自发重组，但不抑制细胞增殖，这表明RAD51依赖的自发重组和DSB诱导的保守重组可以显著受损，而不会影响细胞活力。

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数字

无
图1。差异的过度表达RAD51系列仓鼠细胞中的基因。(A类)的结构RAD51系列使用的基因。这些框对应于不同的RAD51系列基因：灰色，小鼠MmRAD51型; 白色，酵母ScRAD51系列。ScRAD51系列N端较长。白色方框对应于MmRAD51型和阴影框的额外序列。这些数字对应于氨基酸的位置。黑色的数字对应酵母氨基酸，灰色的数字对应小鼠氨基酸。构建嵌合蛋白SMRad51，将ScRad51的N末端部分（孵化盒）融合到整个MmRad51（白盒）。ΔNtScRad51对应于缺失了55个N-末端氨基酸的ScRad51。这些蛋白在CHO-DRA10细胞系中表达，相应的衍生细胞系列在右侧。(B类). 外源性过度表达RAD51系列蛋白质提取物来自稳定的转染体。的表达式MmRAD51型和SMRAD51型使用针对人类Rad51蛋白的抗体进行免疫印迹验证，并使用抗肌动蛋白抗体进行标准化。Rm2和4对应于两个独立的稳定转染体过度表达MmRAD51型SMRad51-1和SMRad51-2对应于两个独立的稳定转染体过度表达融合蛋白SMRAD51型.Cm3是一个对照克隆，对应于用空pCDNA3.1puro质粒转染的CHO-DRA10系。的表达式ScRAD51系列通过使用抗-ScRad51抗体的蛋白质印迹进行可视化。第一条车道对应的瞬态表达式（Tr）为ScRAD51系列（用作控件）。第二条通道对应于模拟转染细胞（CHO-DRA10）的提取物。第三和第四道对应于两个独立的克隆，稳定表达ScRAD51系列.MmRad51是来自的Rad51小家鼠; ScRad51是来自的Rad51面包酵母; CgRad51是来自的Rad51灰仓鼠; SMrad51是一种嵌合融合蛋白MmRad51–ScRad51。
无
图2。用于测量DSB诱导重组事件的策略。在I诱导DSB形成后-Sce公司一、 这两个过程可以相互竞争。(A类)产生Neo的非保守SSA对和潮霉素敏感重组体。(B类)导致有或无交叉的基因转换的同源重组事件。基因转换事件的产物对G418和潮霉素（Neo对–Hyg（高音）对). 染色质内的交叉导致POC的形成。如果取消POC，则产品仅为Neo对; 如果POC重新整合到基因组中，可能会导致Neo对–Hyg（高音）对殖民地。因此，双重阻力（Neo对–Hyg（高音）对)只对保守重组事件进行评分。未显示Hyg的不平等姐妹染色单体交换事件对与尼奥分离对基因。
无
图3。(A类)Ⅰ诱导重组克隆的限制性模式-科学委员会我生成的DSB。探针A对应S2neo启动子序列，探针B对应部分潮霉素抗性基因，位于两者之间新磁带。对应的预期Xho公司I–Hin公司显示了dIII大小（带有两个探针）和相应的抗性表型。POC：弹出圆（见图2）。(B类)用探针A进行Southern blot分析。条带的尺寸显示在面板的侧面。左侧面板：七个独立Neo对–Hyg（高音）对来自控制细胞系Cm3的克隆（在面板顶部编号）。右侧面板：四个独立Neo对–Hyg（高音）对来自Rm2细胞系的克隆（在面板顶部编号），过度表达MmRAD51型. (C类)与（B）中相同的滤波器，但与探针B杂交，具有插入序列的特征。
无
图4。过度表达的影响毫米RAD51，ScRAD51系列或SMRAD51型保守重组事件的频率。对照系指转染空表达载体（Cm3）的亲本系。毫米RAD51指两个独立的转染体过度表达MmRAD51型;ScRAD51系列指一种表达酵母的转染剂ScRAD51系列; SMRad51-1和SMRad51-2是指表达嵌合体的两个独立克隆SMRAD51型; ScRad51ΔNt-1和ScRad51△Nt-23是指表达删除的ΔNt的两个独立克隆科学研究与发展51值对应于双抗（Neo）的百分比对–Hyg（高音）对)菌落（黑匣子）和单抗（Neo对)菌落（灰色方框）。保守重组事件的百分比根据Neo数量的比率计算对–Hyg（高音）对克隆到Neo对克隆频率。百分比显示在相应直方图的顶部。
无
图5。的影响RAD51系列关于辐射阻力(A类)以及辐射诱导复合(B类). 按指示剂量照射细胞。对照组对应于亲本CHO-DRA10系和Cm3，Cm3是用空表达载体转染的CHO-DRA1。Rm2和Rm4是两个过度表达的独立克隆MmRAD51型ScRad51-3和ScRad51-6是表达ScRAD51系列.辐射诱导复合（B）：数值对应于Neo的数量对在10中6减去Neo数量后，存活的受照细胞对在106未辐照细胞。
无
图6。不同基因的过表达的影响RAD51系列自发重组的形式。(A类)MmRAD51型使用Luria和Delbruck检验（Luria and Delbruck1943），通过波动分析测量自发重组率。不同行的名称显示在直方图下。DRA10，父系；Cm3（对照系），DRA10转染空表达载体；Rm2和Rm4对应于两个独立克隆过度表达MmRAD51型每个品系的独立培养物的数量在直方图下报告。(B类)ScRAD51系列和SMRAD51型抑制自发重组的频率。重组率无法计算，因为大多数培养物不包含任何重组体。此处报告的重组频率对应于所有独立培养物中重组物的总和与所有独立培养液中细胞总数的总和。DRA10为父系；ScRad51-3和ScRad51-6对应于表达ScRAD51系列; SMRad51-1、SMRad51-2和SMRad51-24是指表达嵌合体的三个独立克隆SMRAD51型。
无
图7。的角色RAD51系列哺乳动物细胞中的DSB修复。在DSB上，Ku和RAD52型竞争处理DSB。Ku将DSB维修定位于NHEJ。相反，RAD52型将修复定位于HD过程，该过程可以是SSA或同源重组。如果没有RAD51系列，SSA发生。这是父母中最常见的反应。如果mRAD51型存在，它可以绑定到RAD52型并引导反应进入由链侵入引发的同源重组。
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