The Epstein-Barr virus lytic program is controlled by the co-operative functions of two transactivators

doi:10.1093/emboj/19.12.3080

.2000年6月15日；19(12):3080-9.

doi:10.1093/emboj/19.12.3080。

Epstein-Barr病毒裂解程序由两个转录因子的合作功能控制

R进料器¹, M Kost公司, M Baumann先生, A Janz公司, E杜洛埃, W哈默施密特, H J Delecluse公司

附属公司

PMID： 10856251
预防性维修识别码：项目编号：C203345
DOI（操作界面）： 10.1093/emboj/19.12.3080

Epstein-Barr病毒裂解程序由两个转录因子的合作功能控制

R馈线等。欧洲工商管理硕士J. 2000.

.2000年6月15日；19(12):3080-9.

doi:10.1093/emboj/19.12.3080。

作者

R进料器¹, M Kost公司, M Baumann先生, A Janz公司, E杜洛埃, W哈默施密特, H J德勒克吕兹

附属

¹GSF-国家环境与健康研究中心，临床分子生物学和肿瘤遗传学研究所，德国慕尼黑D-81377。

PMID： 10856251
预防性维修识别码：项目编号：C203345
DOI（操作界面）： 10.1093/emboj/19.12.3080

摘要

疱疹病毒的传播长期以来被视为一个由特定病毒转录因子的连续表达引起的时间调控的序列过程。作为这一过程的关键步骤，裂解病毒DNA复制被认为是控制晚期结构病毒基因表达的检查点。在一种新的遗传学方法中，我们表明这两种假设对EBV并不成立。对早期基因BZLF1和BRLF1被删除的EBV病毒突变体的研究允许精确分配这些蛋白的功能。这两种反式激活物对病毒DNA复制是绝对必要的。BZLF1和BRLF1都需要在裂解程序中表达EBV蛋白，尽管这些分子对各种病毒靶基因表达的各自影响差异很大。在复制缺陷型病毒突变体中，早期基因表达和DNA复制都不是晚期基因表达的先决条件。这项工作表明，BRLF1和BZLF1具有不同但互补的功能，影响病毒产生的所有阶段。

PubMed免责声明

数字

**图1。**与野生型B95.8/F因子DNA相比，对BZLF1-KO和BRLF1-KO突变DNA进行限制性片段分析。这个*BZLF1型*通过同源重组与卡那霉素抗性基因交换基因。从氯霉素和卡那霉素耐药菌株中纯化DNA大肠杆菌克隆并消化巴姆HI限制酶。将突变型BZLF1-KO DNA与野生型B95.8/F因子DNA的限制性酶切图谱进行了比较。除了两个例外，这两个限制性片段模式是相同的。通过替换巴姆携带*BZLF1型*基因（B95.8/F因子中1.8kb片段的消失）与携带卡那霉素抗性基因的基因（BZLF1-KO DNA中2.8kb片段的出现）（另见图6A）。两个重新排列的片段都用箭头表示。同样的程序也适用于*BRLF1型*基因。在这种情况下，3.6 kb巴姆携带*BRLF1型*该基因与携带四环素抗性基因的6.9kb片段交换。

**图2。**补充*BRLF1型*和*BZLF1型*突变体。转染BZLF1表达质粒293-BZLF1-KO细胞上清液培养Raji细胞中GFP的表达(A类)或来自转染BRLF1的293-BRLF1-KO细胞(B类). 将1 ml等分上清液与10⁴Raji细胞。感染48 h后检测GFP荧光（左）；相应的相位对比光学显微镜（右侧面板）（放大倍数×200）。用293-BZLF1-KO细胞的上清液培养后，约10%的Raji细胞呈GFP阳性，表明病毒滴度至少为10^三感染病毒/ml。对于293-BRLF1-KO细胞，病毒滴度也可以估计为至少10^三感染病毒/ml。

**图3。**BZLF1和BRLF1的相互诱导。对转染了编码BRLF1或BZLF1的表达载体的293-BZLF1-KO或293-BRLF1-KO细胞进行Western blot分析。上面板：BZLF1表达模式。下部面板：BRLF1表达模式。自发产生EBV病毒的B95.8细胞系用作阳性对照。293-BRLF1-KO与BRLF1表达质粒互补或293-BZLF1-KO与BZLF1表达载体互补均导致两种反式激活子的表达，表明BZLF诱导BRLF1的表达，反之亦然。在转染BRLF1表达质粒的293-BZLF1-KO细胞或转染BZLF1表达载体的293-BRLF1-KO-细胞中，表达模式仅限于转染基因的表达。未转染的293-BZLF1-KO或293-BRLF1-KO细胞提供了额外的阴性对照。

**图4。**表达质粒转染BZLF1-KO和BRLF1-KO病毒突变体后DNA复制的分析*BZLF1型*或*BRLF1型*基因。在潜伏感染EBV的细胞中，病毒DNA以表位体的形式存在。相反，在裂解复制期间，新合成的病毒DNA是线性的。在Gardella琼脂糖凝胶电泳上分离，然后用EBV特异探针进行Southern blot杂交，可以很容易地区分圆形和线形。将BZLF1转染到293-BZLF1-KO细胞系或BRLF1转导到293-BRLF1-KO细胞系后，可以清楚地鉴定出溶血性复制。相反，无论是将BRLF1转染到293-BZLF1-KO细胞系还是将BZLF1转导到293-BRLF1-KO细胞系，都不能产生任何可检测的DNA复制。Raji细胞系对裂解程序有缺陷，被用作阴性对照。

**图5。**BRLF1或BZLF1表达质粒转染293-BZLF1-KO细胞后EBV裂解蛋白EA-D、gB和gp350的产生(A类)或293-BRLF1-KO电池(B类). 在每个面板中，包含一个由未转染细胞组成的阴性对照。固定细胞与特异性单克隆抗体和与Cy5荧光色素偶联的第二抗鼠抗体孵育。在紫外光（放大×100）下观察染色细胞。

**图6。**用BZLF1-KO EBV突变株感染原代淋巴细胞产生的永生B细胞不携带*BZLF1型*基因。(A类)感染BZLF1-KO突变株或野生型EBV的细胞系的Southern blot分析。将印迹与用于产生BZLF1-KO突变体的构建物杂交，该突变体由卡那霉素抗性基因构成，其两侧是前三分之二*BZLF1型*该基因的外显子和序列5′和3′。而野生型EBV携带完整的*BZLF1型*基因（1.8kb片段），在病毒突变株感染的细胞群中只能检测到重组片段（2.8kb片段，见图1）。(B类)感染BZLF1-KO突变株或野生型EBV的细胞系的Western blot分析。在TPA和丁酸诱导后，携带野生型EBV DNA（B95.8和B95.8 LCL）的细胞，但不携带EBV病毒突变体（BZLF1-KO LCL9）的细胞显示出明显的BZLF1蛋白生成。通过SDS–PAGE分离从上述淋巴细胞系中提取的蛋白质（BZLF1-KO突变体为20µg，对照细胞为4µg），将其印在硝化纤维素膜上，并与BZLF1蛋白（Z130）特异性抗体孵育。

**图7。**BRLF1即刻早期蛋白诱导EBV阴性细胞中gp350的表达。EBV晚期蛋白gp350在转染后的表达*gp350型*编码gp350的基因（左面板，放大×100）和联合转染后*gp350标准*基因和BRLF1进入293个细胞（右侧面板，放大×100）。

**图8。**BRLF1蛋白激活*gp350标准*来自已建立启动子的基因。用引物延伸法测定了转染BRLF1表达质粒的293或293-BZLF1-KO细胞gp350 mRNA的5′端。B95.8细胞和未转染的293细胞分别提供阳性和阴性对照。将BRLF1表达质粒导入293或293-BZLF1-KO细胞，可合成gp350特异性mRNA，其大小与B95.8细胞中发现的gp350 mRNA相似。因此，BRLF1介导的gp350 mRNA的激活反映了B95.8细胞EBV裂解程序期间的情况。然而，在B95.8中也可以检测到一个额外的gp350 mRNA转录物，其大小稍短。在这个阶段，尚不清楚这是否反映了B95.8细胞系来源于绒猴细胞的事实，或在病毒裂解复制过程中除BRLF1之外的其他病毒因子的作用。

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1. Beisel C.、Tanner，J.、Matsuo，T.、Thorley-Lawson，D.、Kezdy，F.和Kieff，E.（1985）爱泼斯坦-巴尔病毒的两种主要外膜糖蛋白由同一基因编码。J.Virol。，54, 665–674.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Campbell B.A.和Villarreal，L.P.（1988）多瘤病毒单个增强子核心序列的功能分析：转录DNA复制的细胞特异性解耦联。分子细胞。《生物学》，1993-2004年8月。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Cherepanov P.P.和Wackernagel，W.（1995）大肠杆菌中的基因破坏：TcR和KmR盒，可选择Flp催化切除抗生素抗性决定簇。基因，158，9–14。-公共医学
1. Conley A.J.、Knipe，D.M.、Jones，P.C.和Roizman，B.（1981）《单纯疱疹病毒的分子遗传学》。七、。体外诱变产生的一种温度敏感性突变体的特征，该突变体在DNA合成和γ多肽积累方面存在缺陷。J.Virol。，37, 191–206.-项目管理咨询公司-公共医学

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[10] Conley A.J.、Knipe，D.M.、Jones，P.C.和Roizman，B.（1981）《单纯疱疹病毒的分子遗传学》。七、。体外诱变产生的一种温度敏感性突变体的特征，该突变体在DNA合成和γ多肽积累方面存在缺陷。J.Virol。，37, 191–206.-项目管理咨询公司-公共医学

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