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.2000年6月15日；20(12):4686-700.
doi:10.1523/JNEUROSCI.20-12-04686.2000。

在帕金森病大鼠模型中长期rAAV介导的GDNF基因转移：纹状体内而非黑质内转导促进受损黑质纹状体系统的功能再生

D基里克 1, C罗森布拉德, 比约克隆德, R J曼德尔
附属公司

大鼠帕金森氏症模型中rAAV介导的GDNF的长期基因转移：跨膜内而非跨膜内转导促进病变黑质纹状体系统的功能再生

D基里克等。 神经科学. .

摘要

以前的研究已经使用重组腺相关病毒（rAAV）载体在黑质中传递胶质细胞源性神经营养因子（GDNF），以保护黑质多巴胺（DA）神经元免受6-羟多巴胺诱导的损伤。然而，在这些实验中没有观察到再生或功能恢复。在这里，我们使用rAAV-GDNF载体在黑质DA神经元本身、纹状体靶细胞或这两种结构中长期（6个月）表达GDNF。结果表明，黑质和纹状体转导对黑质多巴胺神经元抵抗毒物诱导的变性具有显著的保护作用。然而，只有在纹状体中接受rAAV-GDNF的大鼠表现出行为恢复，伴随着受损纹状体的显著神经再生，这种再生在损伤后的前4-5个月逐渐发展。在此期间，GDNF转基因表达保持在较高水平。这些结果证明rAAV是一种高效的载体系统，可在黑质纹状体系统中长期表达治疗蛋白。

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数字

图1。
图1。
手术和测试时间表。动物在6-OHDA损伤前4周接受病毒载体注射(−4). 从载体注射后3周开始，使用步进试验对动物进行前肢运动障碍测试(预步骤)其次是自发运动不对称(赞助。腐烂。)和d日-苯丙胺诱导的运动不对称(前置放大器I–二). 在第0周，将6-OHDA注射到纹状体的四个部位，剂量为每个部位7μg。使用反复药物诱导评估术后运动损伤(电流I–VI,阿波罗I–II级、和SKF-82958型I–II; 和自发测试(第一步–V（V）,圆柱和楼梯测验；时间线以下）。如材料和方法所述，在损伤24周后灌注动物进行免疫组织化学分析。
图2。
图2。
在载体注射3周后，评估完整动物的自发运动不对称性。A类，病变前自发旋转。对照组表现出无侧偏倚，这是因为它们在两个方向上的旋转次数与同侧方向（Tukey HSD事后（post-hoc）测试第页= 0.995). 相比之下，SN和STR/SN矢量注入组自发地旋转到矢量注入的对侧(封闭式钢筋)与同侧相比(开放式酒吧，组的主要影响显著F类(3,78)= 6.8;第页=0.0004，Tukey HSD事后（post-hoc），序号第页<0.0001，STR/SN第页< 0.0001).星号表明对侧与同侧旋转显著增加(第页< 0.05).英镑符号（#）表示与对照组相比，旋转速度显著提高(第页< 0.05).B类，苯丙胺释放前旋转。与自发旋转数据类似，对照动物对2.5 mg/kg苯丙胺的反应没有表现出不对称行为。然而，所有注射rAAV-GDNF的动物在与载体注射相反的方向上表现出高度显著的不对称性(封闭式钢筋).星号表明与同侧旋转率相比，对侧旋转率明显更高(第页< 0.05).英镑符号（#）表示与对照组相比，对侧旋转速度更大(第页< 0.05). 注意中的不同比例A类和B类.
图3。
图3。
损伤后苯丙胺诱发的运动不对称。纹状体6-OHDA损伤4周后，所有组均显示出明显的同侧旋转，这在组间是等效的(第页>0.5，简单的主要效果）。然而，早在6-OHDA损伤后7周，STR载体注射组就开始显示苯丙胺诱导的旋转减少。从10周及以后，STR组与所有其他组有显著差异（组的主要作用；F类(3,39)= 3.464,第页= 0.03).星号表明与STR组早期时间点的显著差异磅符号（#）表示与所有其他组的显著差异(第页通过简单主效应<0.05）。所有值均为平均值±SEM。
图4。
图4。
自发行为。A类，在6-OHDA损伤3周后，使用圆柱体试验（Schallert和Tillerson，1999）评估肢体的自发使用。在这个时间点，所有组都存在高度显著的同侧偏倚，这表明在这个测试中只有10-15%的对侧肢体使用(F类(1,76)= 0.408,第页= 0.52).B类，在6-OHDA损伤23周后再次进行圆柱体试验。此时，所有组都有了总体改善（时间的影响第页= 0.001). STR组的改善更为明显，但这一趋势没有达到显著性（群体效应第页= 0.07). 然而，仅考虑在苯丙胺诱导旋转试验中表现出完全补偿的STR组动物（8/11只动物，STR-压缩机)，这些动物用对侧爪子接触圆柱体侧面，接近正常水平（～45%），它们的表现明显好于无补偿动物和对照组(F类(1,39)= 17.5,第页< 0.0001).C类楼梯（熟练肢体使用）测试，来自对侧爪子的数据。使用标准窄平台进行第一阶段测试（第1-7天）。两组的表现有显著差异(F类(3,39)= 5.4,第页= 0.003). 在测试过程中，各组都有所改善（培训效果；F类(6,234)= 46.5,第页<0.0001），但组间学习率没有差异（时间×组间交互作用，F类(18,234)= 1.6,第页= 0.058). 然而，STR组在所有时间内都能成功取出比其他三组多得多的颗粒(星号; 简单的主要效果，第页<0.02），而对照组、SN组和SN+STR组的表现没有差异（简单的主要影响，第页>每天0.1）。从第8天开始，通过使用更宽的平台，测试变得更加困难。在这部分测试中，各组在成功回收粒剂的能力上存在差异(F类(3,39)= 3.2,第页= 0.035). STR组的表现再次显著优于所有其他组(星号，简单的主要效果，第页<0.05，第8天和第10天除外，其中0.08>第页> 0.05). SN组在第8天和第12天的表现明显差于对照组和SN+STR（†，简单的主要影响，第页<0.05），而对照组和SN+STR组在任何时间点的表现都没有差异(第页>每天0.4）。D类楼梯（熟练肢体使用）测试，来自同侧爪子的数据。在所有四组中，同侧爪子的表现明显优于对侧爪子(第页< 0.0001).电子,F类，对侧表现(电子)和同侧前肢(F类)在步进测试中。在损伤前测试中(灰色阴影列)两边的组之间没有差异(F类(3,78)= 0.3,第页= 0.82). 病变严重影响各组对侧台阶数（侧效应；F类(1,78)= 543.9,第页<0.0001），而同侧的表现不受影响。在这项测试中，任何一组都没有随着时间的推移而得到改善。中的图例右下角指代表每个组的符号，适用于C–F类所有数值均为平均值±SEM。
图5。
图5。
中央纹状体TH免疫细胞化学染色。6-OHDA损伤导致对照组TH阳性纤维变性(B类). 注意STR中TH阳性纤维神经支配的强度较高(D类)组。SN中的神经支配(C类)和SN+STR(电子)各组与对照组无差异。中的比例尺A类代表500μm，也适用于B–E类. The插入显示了纹状体中TH阳性纤维的密度，如草图所示，该密度是在七个吻腭水平测量的。对照组6-OHDA损伤导致纹状体TH阳性神经广泛变性。两组之间纹状体TH阳性纤维密度存在高度显著差异(F类(3,273)= 18.6,第页< 0.0001). 与所有组的后部区域（IV–VII级）相比，前部区域（I–III级）相对较少(F类(6,273)= 5.2,第页< 0.0001). 然而，没有显著的水平×群体交互作用(F类(18,273)= 0.60,第页= 0.92); 因此，事后（post-hoc）组间测试不分等级。与所有其他组相比，STR组在所有口腔粘膜水平上显示出明显更高的TH纤维密度(*第页< 0.05; Tukey HSD）。所有值均为平均值±SEM。
图6。
图6。
苍白球和侧纹状体尾部的TH免疫细胞化学染色。通过GP的正常终前轴突（如A类)在控件中丢失(B类). 注意到GP和纹状体中STR组的发芽(D类). 在SN+STR组中，GP中观察到较低强度的发芽(电子)SN组完全缺失(C类).箭头指向高倍显示的单个图形附近的区域。中的比例尺A类代表500μm，也适用于B–E类.
图7。
图7。
MFB的TH免疫细胞化学染色。在未经治疗的大脑中观察到TH阳性轴突成束分布(A类). 由于损伤，位于束背侧的大多数轴突丢失(B类). 注意SN和SN+STR组中的异常发芽(C、 E类)STR组正常模式的保存(D类).矩形以高倍显示单个图形附近的区域。比例尺（如所示A类):A–E500微米。
图8。
图8。
黑质细胞体的TH免疫细胞化学染色。注意所有GDNF载体注射组致密部TH阳性细胞体的保护(C类–电子)与受损控件相比(B类). 比例尺（如所示A类):A类–电子500微米。这个插入显示了损伤后27周使用材料和方法中描述的体视学计数方法估计的黑质TH阳性细胞数。在未经治疗的大脑半球，四组中TH阳性细胞的数量非常相似(第页> 0.99). 6-OHDA损伤导致对照组TH+细胞减少～88%。所有rAAV-GDNF治疗组的黑质TH阳性细胞均受到显著保护（ANOVA，其次为事后（post-hoc）Tukey HSD测试，第页<0.0001）：SN组和SN+STR组分别为91和78%（Tukey HSD测试，第页> 0.99). STR组TH阳性细胞的保护作用显著降低，为57%（Tukey HSD试验，第页<0.05），但TH阳性的黑质细胞存活率与对照组相比仍非常显著*第页<0.0001与完好侧不同；+第页<0.0001与所有其他组不同。条形图中的值表示TH阳性细胞与完整侧相比的百分比。所有值均为平均值±SEM。
图9。
图9。
受损和未受损动物中rAAV-GFP转导的示例。A类，损伤对照，存活6个月；后纹状体单个注射部位的rAAV-GFP转导。纹状体和GP中均可见GFP阳性细胞箱在纹状体(STR公司)表示所示的放大区域B类、和箱在中普通合伙人表示所示的放大区域C类.比例尺，500μm。科科斯群岛胼胝体。B类，GFP表达细胞，沿注射道具有神经元形态。比例尺，100μm。C类，注射部位远端GP中GFP阳性神经元（比例尺，如B类).D类，rAAV-GFP在完整动物黑质中的转导（存活4周）。整个黑质致密部都有转导(SNc公司)以及沿着针轨的背面(箭头).信噪比黑质，网状部。这个箱表示中的放大区域电子.比例尺，500μm。电子高倍镜下GFP阳性细胞在形态学上与黑质致密部DA神经元一致。比例尺（如所示电子):电子–G公司，50微米。在同一动物中，GFP阳性纤维可以沿着黑质纹状体通路的长度追踪。观察到这些纤维在纹状体中分支成细小的GFP阳性终末斑块(G公司).
图10。
图10。
载体注射6个月后，GDNF免疫反应在STR的四个水平上显示(A类,D类,G公司,J型)，锡(B类,电子,H（H）,K（K）)和SN+STR(C类,F类,我,L（左）)组，从每组的同一标本中取出。最前面的水平(A–C)图示了中央条纹区域。注意STR组和SN+STR组腹侧纹状体和邻近皮层的弥漫细胞外染色和免疫反应细胞分布(A类,C类). 下一个后水平(D–F型)图示GP和尾部纹状体。同样，在纹状体转导的动物中，GDNF免疫反应覆盖纹状体和GP(B类,F类). 在两个纹状体中均观察到GDNF阳性细胞分布(C类,M（M）)和GP(F类,N个)SN+STR组。在SN组，中央纹状体和尾部纹状体以及GP均无GDNF免疫反应(B类,电子). 在EP层面(G–I)，STR组EP中观察到GDNF免疫反应(G公司)，位于丘脑腹侧(Th（第个）)在序号组中(H（H）)SN+STR组中的MFB、Th和EP(我). 注意染色局限于网状组织(信噪比)STR组中(J型)SN组和SN+STR组染色更广泛(K（K）,L（左）). 这个箱在里面C类表示所示的放大区域M（M），的箱在里面F类表示中的放大区域N个、和箱在里面L（左）表示所示的放大区域O（运行）.集成电路，内囊。比例尺：A–F，1毫米；G–L750微米；M（M），50μm（也适用于N个,O（运行）).
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