CpG methylation as a mechanism for the regulation of E2F activity

doi:10.1073/pnas.100340697

.2000年6月6日；97(12):6481-6.

doi:10.1073/pnas.100340697。

CpG甲基化作为E2F活性调节机制

M R Campanero先生¹, M I阿姆斯特朗, E K弗莱明顿

附属公司

PMID： 10823896
预防性维修识别码：项目经理18629
内政部： 10.1073/pnas.100340697

CpG甲基化作为调节E2F活性的机制

M R Campanero先生等人。美国国家科学院院刊. 2000.

.2000年6月6日；97(12):6481-6.

doi:10.1073/pnas.100340697。

作者

M R Campanero先生¹, M I阿姆斯特朗, E K弗莱明顿

附属

¹哈佛医学院癌症免疫与艾滋病系和美国马萨诸塞州波士顿宾尼街44号Dana-Farber癌症研究所，邮编：02115。

PMID： 10823896
预防性维修识别码：项目经理18629
内政部： 10.1073/pnas.100340697

摘要

通过CpG二核苷酸胞嘧啶残基的甲基化调节哺乳动物的基因表达参与了肿瘤的发展和进展。由于许多参与细胞增殖控制的基因受到转录因子E2F家族成员的调节，并且一些E2F DNA结合位点在体内被甲基化，因此我们研究了CpG甲基化是否可以调节E2F功能。我们在这里表明，来自二氢叶酸还原酶、E2F1和cdc2启动子的E2F元件的甲基化阻止了所有被测E2F家族成员（E2F1到E2F5）的结合。相反，来自c-myc和c-myb启动子的E2F元件的甲基化对E2F2、E2F3、E2F4和E2F5的结合影响最小，但显著抑制E2F1的结合。与这些研究一致，E2F3（而非E2F1）通过源自c-myb和c-myc基因的甲基化E2F位点激活转录，而E2F1和E2F3都无法对甲基化二氢叶酸还原酶E2F位点控制的报告基因进行转录。总之，这些数据说明了一种控制E2F活动的方法。

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数字

图1
(A类)E2F调节启动子dhfr、E2F1、cdc2、c-myb和c-myc的CpG密度图。地图上有dhfr、E2F1、cdc2、c-myb、c-myc和p16（作为参考）5′基因序列，指示每个CpG二核苷酸的位置（垂直线）及其频率。E2F元件和转录起始位点（标记）的位置被指出。E2F1启动子内的两个E2F元件仅相距5 bp，并且仅由一个括号表示。P1和P2表示两个已知的c-myc启动子。所分析的基因序列的大小以每个图上方的碱基对表示。(B类)来自dhfr、E2F1、cdc2、c-myb和c-myc启动子的E2F元件的比对。每个元素中的CpG二核苷酸都有下划线。

图2
的绑定*在体外*翻译成不同E2F元件的DP1/E2F受CpG甲基化调控。DP1和E2F1、E2F2、E2F3、E2F4或E2F5被联合翻译*在体外*以及由此产生的异二聚体与E2Fdhfr、E2F的相互作用_E2F1-A型、E2F_E2F1-B型，通过EMSA分析E2Fcdc2、E2Fc-myb和E2Fc-myc放射性标记的探针。在标记之前，DNA探针要么用Sss I（+）甲基化，要么用对照甲基化（-）。对照组（CNTL）中未添加cDNA在体外转录-翻译反应。仅显示了延迟E2F/DNA复合物。

图3
内源性E2F因子与不同E2F元件的结合受CpG甲基化调控。(A类)B淋巴细胞母细胞系X50-7的核提取物与所示甲基化（+）或对照甲基化（−）的放射性标记E2F元素在脱氧胆酸钠存在下孵育（以中断E2F/pRb家族成员的相互作用）。用EMSA分析E2F-DNA复合物的形成。游离E2F/DP异二聚体的位置用括号表示。箭头和箭头分别表示仅结合E2Fc-myb探针和甲基化E2Fc-myc探针的特定复合物。(B类)S期同步化NIH 3T3细胞的核提取物与所示的放射性标记E2F元素孵育。在添加标记探针之前，将提取物在没有（无）或存在指示抗体的情况下预培养20分钟。对照，正常兔血清。(C)S期同步NIH 3T3细胞的核提取物与指示的甲基化（+）或对照甲基化（−）放射性标记探针孵育。箭头指示游离DP1/E2F1异二聚体的位置。

图4
视网膜母细胞瘤蛋白与E2F家族成员的结合并不影响与甲基化E2F元件结合的特异性。用E2F1/DP1、E2F2/DP1和E2F3/DP1或相应的空载体[CNTL（E2F）]以及视网膜母细胞瘤表达载体（+pRB）或相应的对照载体（CNTL）转染U2OS细胞。EMSA使用指示的甲基化（+）或对照甲基化（−）放射性标记E2F探针（*）分析转染细胞的核提取物。箭头指向与甲基化E2Fc-myc探针唯一结合的复合物。由于非甲基化E2Fc-myc还结合一种与游离E2F形式共迁移的非E2F因子（M.R.C.和E.K.F.，未发表的观察结果），因此E2Fc-myc小组中显示的实验是在存在100摩尔过量的特异性结合该因子而非E2F蛋白的冷竞争物寡核苷酸的情况下进行的。

图5
E2F3（而非E2F1）通过甲基化E2F-DNA结合位点子集有效激活转录。(A类)所用报告质粒的示意图。将来自dhfr（dhfr-wt和met-dhfr）、c-myb（c-myb-wt和met-c-myb）和c-myc（c-myc-wt和mes-c-myc）基因的一个不相关DNA序列（对照）或两个野生型和甲基化E2F元件拷贝直接连接到β-珠蛋白TATA盒的上游。来自不与E2F蛋白相互作用的dhfr（dhfr-mut）和c-myb（c-myb-mut）基因的突变E2F结合位点被用作额外的对照。注意，尽管c-myb突变E2F元件不与E2F因子结合，但它保留了与E2F结合位点重叠区域相互作用的另一因子结合的能力（图3；参考文献24）。由于未甲基化和甲基化的野生型c-myb E2F位点同样结合该因子，因此该c-myb-mut是一种适当的控制。E2F-BS、E2F结合位点。(B类–*G公司*)将指定数量的DP1/E2F1（E2F1）和DP1/E2F3（E2F3）表达载体以及0.5μg pRc-CMV-β-gal和≈1μg中描述的荧光素酶报告载体转染Saos-2细胞A类。代表性实验中的荧光素酶值（针对β-半乳糖苷酶活性进行标准化）代表了与在没有E2F/DP表达载体的情况下转染的细胞相关的每个荧光素酶载体。

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