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.2000年5月；20(9):2970-83.
doi:10.1128/MCB.20.9.9970-2983.2000。

SPT5蛋白中调节其转录调控特性的结构域

D伊万诺夫 1, Y T Kwak先生, J郭, R B盖诺
附属公司

SPT5蛋白中调节其转录调控特性的结构域

D伊万诺夫等。 分子细胞生物学. 2000年5月.

摘要

SPT5及其结合伙伴SPT4通过RNA聚合酶II调节转录延伸。SPT4和SPT5参与5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB）介导的转录抑制和人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）Tat蛋白激活转录延伸。最近的数据表明，由CDK9和细胞周期蛋白T1组成的P-TEFb在通过SPT4和SPT5调节转录延伸方面也很关键。在本研究中，我们分析了SPT5的结构域，这些结构域在DRB或HIV-1 Tat蛋白存在的情况下调节转录延伸。我们证明，结合SPT4和RNA聚合酶II的SPT5结构域，以及SPT5 C末端包含多个七肽重复序列并被指定为CTR1的区域，对于DRB的体外转录抑制和Tat蛋白的激活至关重要。此外，SPT5 CTR1结构域是P-TEFb磷酸化的底物。这些结果表明，SPT5中的C末端重复序列与RNA聚合酶II C末端结构域中的重复序列一样，是P-TEFb磷酸化的位点，并在调节其转录延伸特性中发挥作用。

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图1
图1
SPT5蛋白示意图。（A） SPT5蛋白的酸性结构域位置示意图，这四个KOW结构域与大肠杆菌显示NusG蛋白和两个结构域CTR1和CTR2，每个结构域都有多个氨基酸重复。（B） 显示了SPT5蛋白不同结构域中具有突变的多种结构。利用体内相互作用和体外转录试验分析这些突变体的功能。
图2
图2
SPT5与SPT4、RNA聚合酶II和CDK9的相关性。（A） 将含有Myc-tagged SPT4构建物或指示的Flag-taged SPT5构建物的表达载体共转染到COS细胞中。从每一种转染中制备提取物，并使用针对Myc表位的抗体通过Western blot分析分析SPT4水平（上图）。从SPT4-SPT5共转染细胞制备的提取物用M2单克隆抗体免疫沉淀以分离标记的SPT5蛋白，然后用针对Myc表位的单克隆抗体进行Western blot分析以检测表位标记的SPT蛋白（下面板）。在泳道2中，将含有SPT4 cDNA的表达载体单独转染到COS细胞中，而不共转染SPT5 cDNA。（B） 使用M2单克隆抗体对转染含有标记SPT5 cDNA构建物（1到17道）或标记SPT4 cDNA（18道）的表达载体后制备的COS细胞提取物进行Western blot分析。在通道1中，含有SPT4的表达载体与野生型SPT5构建物共转染。MW，分子量单位为千。（C和D）分别将标记的SPT5构建物转染到COS细胞中，并制备提取物。用针对RNA聚合酶II CTD（C）或CDK9（D）的抗体对这些提取物进行免疫沉淀。然后用M2单克隆抗体进行蛋白质印迹分析以检测Flag标记的SPT5。
图3
图3
体内外SPT5与RNA聚合酶II和CDK9的相关性。（A） HeLa核提取物与免疫前血清（第2和第5道）或针对SPT5的兔多克隆抗体（第3和第6道）免疫沉淀。图中显示了接受免疫沉淀处理的总共20%的HeLa核提取物（通道1和4）。免疫沉淀后，使用针对RNA聚合酶II（Pol II）CTD（1至3道）或CDK9（4至6道）的抗体进行Western blot分析。（B） 将纯化的RNA聚合酶II（泳道1-4）或杆状病毒纯化的CDK9/细胞周期蛋白T1（泳道5-8）未经处理（30%的输入显示在泳道1和5中），或与含有GST的谷胱甘肽琼脂糖珠（泳道2和6）、GST-SPT5（泳道3和7）或从aa 1延伸至754的GST-SPT5融合蛋白（泳道4和8）一起孵育。在广泛清洗后，使用针对RNA聚合酶II CTD（1到4道）或CDK9（5到8道）的抗体进行Western blot分析。
图4
图4
重组SPT5蛋白重建DRB抑制和Tat激活。（A） 使用未经分离的HeLa核提取物（Nuc-Ext）（1区）、表位标记的SPT4和SPT5 cDNA转染COS细胞（2区）后产生的亲和纯化SPT4-SPT5复合物、杆状病毒表达和纯化的SPT4-SPAT5（3区）、，或10μl（车道4）或50μl（道路5）等分HeLa核提取物1.0 M醋酸钾部分，通过磷酸纤维素（PC）色谱获得。（B） 亲和纯化SPT4和SPT5蛋白的Western blot分析。将含有不同标记SPT5 cDNA构建物和Myc标记SPT4 cDNA构建体的表达载体共转染到COS细胞中。通过结合含有M2单克隆抗体的蛋白G珠，然后用Flag肽洗脱，纯化这些提取物中的Flag表位标记的SPT5和相关SPT4蛋白。用抗Flag单克隆抗体进行Western blot分析以检测SPT5蛋白（顶面板）或抗Myc单克隆抗体检测相关SPT4（下面板）。（C） 用pTF3-6C进行体外转录分析2AT模板使用未分离的HeLa核提取物（NE）（通道1和2），或从磷酸纤维素（PC）柱（通道3至24）洗脱的HeLa-核提取物的1.0 M醋酸钾部分。对1.0 M醋酸钾部分进行单独分析（第3和第4道），单独添加亲和纯化的SPT4（第5和第6道），独自添加亲和精制的SPT5（第7和第8道），或如图所示添加面板B中所示SPT4和不同亲和纯化SPT5蛋白（第9至24道）。在体外转录分析中，DRB被添加到均匀编号的通道中。（D） 使用HIV-1 LTR野生型（顶面板）或HIV-1 LT R环突变体（下面板）模板进行体外转录分析，模板使用未分离的HeLa核提取物（通道1至4），HeLa细胞核提取物的1.0 M醋酸钾部分仅从磷酸纤维素（PC）柱洗脱（通道5和6），或1.0 M醋酸钾部分，存在亲和纯化的SPT4和SPT5蛋白（第7和8道）、单独的SPT5（第9和10道）或SPT4及亲和纯化SPT5突变体（第11至24道），如图所示。在体外转录分析中，将Tat（25 ng）添加到奇数车道上，将GST（25 ng）添加到偶数车道上。在用这些含有无G盒的模板进行体外转录分析后，用RNase T消化标记的RNA1进行凝胶电泳和放射自显影。
图5
图5
SPT5的P-TEFb磷酸化。（A） 在不存在GST-SPT5底物的情况下，在体外激酶分析中检测杆状病毒产生和纯化的蛋白质，包括CDK9（第1和第6道）、CDK9和细胞周期蛋白T1（第2和第7道）、CDK9和周期蛋白T2a（第3和第8道）以及CDK9与细胞周期蛋白T2b（第4和第8车道），单独检测GST-SPT底物（第5道），或者将GST-SPT5底物与不同的CDK9制剂一起加入（泳道6至9）。（B） 使用针对CDK9（顶面板）、细胞周期蛋白T1（中面板）或细胞周期蛋白T2（下面板）的抗体，在Western blot分析中对杆状病毒产生和纯化的CDK9制剂（第1条通道）、CDK9制品和细胞周期蛋白T1（第2条通道），CDK9和细胞周期素T2a（第3条通道）以及CDK9与细胞周期蛋白T2b（第4条通道）进行分析。
图6
图6
SPT5结构的P-TEFb和CAK磷酸化的比较。（A） 纯化的RNA聚合酶II（Pol II）在体外激酶测定中使用单独的RNA聚合酶II（泳道1）或在杆状病毒产生和纯化的CAK（包括CDK7、细胞周期蛋白H和MAT1）（泳道2）或CDK9和细胞周期蛋白T1（泳道3）的存在下进行测定。MW，分子量单位为千。（B） 使用杆状病毒生产的CDK9/cyclin T1（1到6道）或CAK（7到12道）制剂进行体外激酶分析，这些制剂没有添加底物（1道和7道）、GST-SPT5（2道和8道）、GSM-SPT5（aa 1到754）（3道和9道）、GPS-SPT5，或GST-SPT5（aa 760至1087）（6车道和12车道）。在SDS-PAGE和放射自显影后检测磷酸化。（C） 显示了用于B部分体外激酶分析的各种GST-SPT5融合蛋白的考马斯蓝染色凝胶。
图7
图7
SPT5 CTR1重复序列的P-TEFb和CAK磷酸化的比较。（A） CTR1和CTR2的序列重复。如前所述（49），SPT5的CTR1和CTR2结构域中的C末端重复基序的位置以及每个结构域的一致序列都已指示。（B） 显示了与GST融合并用作体外激酶反应底物的两个CTR1重复序列。方框表示重复序列的位置，突变的氨基酸以粗体显示。（C） 使用杆状病毒产生和纯化的CDK9-cyclin T1（1到6道）或杆状病毒生成和纯化的CAK成分（包括CDK7、cyclin H和MAT1（7到12道））进行体外激酶反应。激酶反应在不添加底物（第1和第7道）或添加GST（第2和第8道）、包含RNA聚合酶II CTD两个重复序列（第3和第9道）的GST-CTD融合蛋白或包含两个具有野生型（WT）序列（第4和第10道）的CTR1重复序列的GST融合蛋白的情况下进行，丝氨酸残基取代丙氨酸（通道5和11），或苏氨酸残基代替丙氨酸（路径6和12）。（D） 显示了GST融合蛋白的考马斯蓝染色SDS-聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶用作面板B中激酶分析的底物。
图8
图8
P-TEFb磷酸化对SPT4-SPT5功能在介导DRB阻遏中的作用。（A） 用pTF3-6C进行体外转录检测2存在（偶数车道）或不存在（奇数车道）DRB的AT模板。体外转录分析中使用了未经处理的HeLa核提取物（通道1和2）、用GST抗体免疫缺失的HeLa-核提取物（区域3和4）或用SPT5抗体免疫缺失（通道6至20）。在没有其他处理的情况下，用杆状病毒表达后纯化的SPT4-SPT5复合物（第7和第8道）、用P-TEFb预培养的SPT4-SPT5复合体（第9和第10道以及第15和第16道）、，SPT4-SPT5复合体在没有P-TEFb的情况下预孵育（11和12道以及17和18道），或者在没有SPT4-SPAT5的情况下单独预孵养P-TEFb[13和14道以及19和20道]。预孵育程序是在没有ATP（9至14道）或存在5 mM ATP（15至20道）的情况下进行的，随后通过透析去除。（B） 显示了本研究中分析的SPT5蛋白的功能域示意图。
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