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。2000年4月3日；19(7):1576-86.
doi:10.1093/emboj/19.7.1576。

非典型PKC相互作用蛋白p62通过IL-1-TRAF6途径激活NF-kappaB

L桑兹 1, M T迪亚兹机械, H Nakano公司, J莫斯卡特
附属公司

非典型PKC相互作用蛋白p62通过IL-1-TRAF6途径介导NF-κB活化

L桑兹等。 欧洲工商管理硕士J。 。

摘要

非典型蛋白激酶C（aPKC）相互作用蛋白p62先前已被证明与RIP相互作用，通过肿瘤坏死因子α（TNFalpha）将这些激酶与NF-kappaB活化联系起来。aPKCs与TNFalpha刺激细胞中IKKbeta的激活有关，并被证明是对白细胞介素-1（IL-1）的反应。在这里，我们证明了aPKC的抑制或p62的下调严重抵消了IL-1和TRAF6对NF-kappaB的激活，表明这两种蛋白都是这一途径中的关键中介体。与此相一致，我们发现在联合转染实验中，p62选择性地与TRAF6的TRAF结构域相互作用，而不是与TRAF5或TRAF2的TRAF区域相互作用。内源性p62与TRAF6的结合是刺激依赖性的，强化了这是一种生理相关的相互作用的概念。此外，我们证明了TRAF6的N末端结构域是信号传递所必需的，它以二聚依赖的方式与zetaPKC相互作用。总之，这些结果表明，p62不仅在TNFalpha中是一个重要的中介体，而且在通过特定适配器RIP和TRAF6向NF-kappaB发送IL-1信号中也是一个重要中介体。

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数字

无
图1。λ/κPKC和p62在IL–1激活NF–κB中的作用。将1 ngκB荧光素酶报告基因质粒转染HepG2细胞亚流培养物，同时转染1或2μg HA标记的野生型或λ/∏PKC显性阴性突变体、HA标记的αPKC显性负突变体或反义p62质粒（p62AS公司)，以及足够的空载体，以提供2.5μg的总DNA。24小时后，用IL–1β刺激或不刺激细胞（1 ng/ml，持续4小时），制备提取物，并按照材料和方法中的说明测定荧光素酶活性水平。结果是三个独立实验的平均值±标准偏差，两个实验分别进行孵育。下面的面板显示了其中一个实验中HA标记结构和p62水平表达的代表性控制斑点。
无
图2。λ/κPKC和p62在TRAF6、IRAK和MyD88激活NF–κB中的作用。将1 ngκB-荧光素酶报告基因质粒和0.1μg Flag-TRAF6转染293细胞亚流培养物(A类)、HA–IRAK、Flag-IRAK2或Myc-MyD88(B类)含或不含1或2μg HA–λ/l.PKC显性阴性突变体MUT公司)（A和B），2μg HA–p62（A）表达载体或反义p62质粒（p62AS公司)（A和B），以及足够的空载体，得到2.5μg的总DNA。24小时后，制备细胞提取物并测定荧光素酶活性水平。结果是三个独立实验的平均值±标准偏差，两个实验分别进行孵育。下面的面板显示了其中一个实验中不同标记结构和p62水平表达的代表性控制斑点。
无
图3。在TRAF6诱导的JNK激活中，p62和λ/∏PKC缺乏作用。用3μg Flag-TRAF6转染293细胞亚流培养物，转染或不转染6或10μg HA–λ/l.PKC显性阴性突变体MUT公司)或反义p62质粒（p62AS公司)，和足够的空载体，得到20μg的总DNA。24小时后，制备细胞提取物，并用抗磷酸Jun抗体通过免疫印迹分析测定磷酸Jun。提取物也用Flag和HA表位以及p62的抗体进行免疫印迹。这是另外两个具有类似结果的代表性实验。
无
图4。互动体内p62中含有TRAF6，但不含有TRAF2或TRAF5。将4μg Myc-p62表达质粒单独或与15或20μg Flag-TRAF6、2.5、5或10μg Flage-TRAF5联合转染在直径100 mm的平板中的293个细胞亚流培养物(A类)或2、4或6μg HA–TRAF2(B类)和足够的pCDNA3质粒，以产生25μg的总DNA。转染后（24 h），用抗Flag（A）或抗HA（B）抗体免疫沉淀细胞提取物，然后用抗Myc抗体免疫印迹分析免疫沉淀。将等分[用于免疫沉淀的提取物（Ext）量的十分之一]装入凝胶中，并用相应的抗抗原抗体进行免疫印迹分析。如图所示的凝胶(C类)表明Myc-p62在所有转染点的表达量是可比较的。在另外三个独立实验中获得了基本相同的结果。
无
图5。ζPKC与p62和TRAF6形成三元络合物。将293个细胞在100 mm直径的平板中的亚流培养物转染4μg Myc-p62和5μg HA–ζPKC表达质粒，或者单独转染，或者与20μg Flag-TRAF6和足够的pCDNA3质粒联合转染，以获得30μg总DNA。转染后（24小时），用抗-Myc或抗-Flag抗体对细胞提取物进行免疫沉淀，之后用抗-Flag、抗-Myc或抗-HA抗体通过免疫印迹分析免疫沉淀。将等分[用于免疫沉淀的提取物（Ext）量的十分之一]装入凝胶中，并用相应的抗抗原抗体进行免疫印迹分析。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。
无
图6。内源性p62与TRAF6的相互作用依赖于IL-1。(A类)用25μg Flag-TRAF6表达载体转染直径为100 mm的HepG2细胞亚流培养物。转染后24小时，细胞未经处理或用IL-1（1 ng/ml）刺激不同时间。然后，用预先免疫或抗p62多克隆抗体对细胞提取物进行免疫沉淀，并用单克隆抗体对免疫沉淀进行免疫印迹分析。将等分[用于免疫沉淀的提取物（Ext）量的十分之一]装入凝胶中，并用抗Flag抗体进行免疫印迹分析。在另外三个独立实验中获得了基本相同的结果。(B类)HepG2细胞在直径100 mm的平板中的亚流培养物在不同时间内用IL–1（1 ng/ml）刺激或不刺激。然后，用多克隆抗p62抗体对细胞提取物进行免疫沉淀，并用单克隆抗TRAF6和抗p62的抗体进行免疫印迹分析免疫沉淀。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。
无
图7。TRAF6将p62链接到IRAK。将4μg Myc-p62表达质粒单独或与4μg HA–IRAK（含或不含15μg Flag-TRAF6）和足够的pCDNA3质粒联合转染HepG2细胞在直径为100 mm的平板中的亚流培养物，得到25μg的总DNA。转染后（24小时），细胞未经处理或用IL–1刺激10分钟。用抗Myc抗体免疫沉淀细胞提取物，然后用抗HA抗体免疫印迹分析免疫沉淀。将等分[用于免疫沉淀的提取物（Ext）量的十分之一]装入凝胶中，并用相应的抗抗原抗体进行免疫印迹分析。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。
无
图8。IL-1刺激细胞中p62与TRAF6和IRAK的共聚焦。用Flag-TRAF6和HA–IRAK以及GFP–p62构建物转染HepG2细胞，然后对细胞进行处理(A类)或用IL–1刺激10分钟(B类). 然后用兔多克隆抗HA抗体和抗兔Alexa 594抗体（红色荧光）检测IRAK，用单克隆抗Flag抗体和抗小鼠Cy5抗体（蓝色荧光）检测TRAF6，用三重共聚焦激光扫描显微镜分析细胞。绿色荧光表示GFP–p62的表达。在另外两个独立的实验中获得了基本相同的结果。
无
图9。用于映射p62–TRAF6和p62–RIP交互域的各种结构的示意图。按照材料和方法中的说明准备构件。AS、酸性序列和ζPKC相互作用区；ZZ，锌指域。
无
图10。p62与TRAF6和RIP的同时相互作用。用4μg HA–p62表达质粒和5μg Flag-RIP单独或与5、10或15μg Flage-TRAF6和足够的pCDNA3质粒联合转染直径为100 mm的培养板中293个细胞的亚流培养物，以获得25μg的总DNA。转染后（24 h），用抗HA抗体免疫沉淀细胞提取物，然后用抗Flag抗体免疫印迹分析免疫沉淀。将等分[用于免疫沉淀的提取物（Ext）量的十分之一]装入凝胶中，并用相应的抗抗原抗体进行免疫印迹分析。在另外三个独立实验中获得了基本相同的结果。
无
图11。p62与TRAF6的TRAF结构域的相互作用。用标记的野生型TRAF6（15μg）表达质粒或缺失TRAF6 N端结构域的突变体（20μg；TRAF6–C）转染293细胞亚流培养物(A类)或与HA–TRAF2（7.5μg）或25μg HA–标记嵌合结构TRAF2/6或TRAF6/2(B类)以及4μg控制载体或Myc-p62表达质粒。用抗标志（A）或抗HA（B）抗体免疫沉淀细胞提取物，并用抗Myc（A和B）、抗标志（A）或抗HA（B）的抗体免疫印迹分析免疫沉淀。将等分[用于免疫沉淀的提取物（Ext）量的十分之一]装入凝胶中，并用抗Myc抗体进行免疫印迹分析。在另外三个独立实验中获得了基本相同的结果。
无
图12。TRAF6的N端结构域以二聚依赖的方式与ζPKC相互作用。将10μg pCDNA3或HA–TRAF6ΔC-Gyr构建的表达质粒以及7.5μg Myc-ζPKC表达载体转染直径为100 mm的平板中293个细胞的亚流培养物。转染后（24 h），用CM刺激或不刺激细胞15 min，然后用抗HA抗体免疫沉淀细胞提取物，并用抗Myc和抗HA抗体分析免疫沉淀。将等分[用于免疫沉淀的提取物（Ext）量的十分之一]装入凝胶中，并用抗Myc抗体进行免疫印迹分析。在另外三个独立实验中获得了基本相同的结果。
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