Silencing of retrotransposons in arabidopsis and reactivation by the ddm1 mutation

doi:10.1105/tpc.12.3.357

.2000年3月；12(3):357-69.

doi:10.1105/tpc.12.3.357。

拟南芥反转录转座子的沉默和ddm1突变的激活

H Hirochika公司¹, H冈本, T卡库塔尼

附属公司

PMID： 10715322
预防性维修识别码：项目经理139836
内政部： 10.1105/tpc.123.357

拟南芥反转录转座子的沉默和ddm1突变的激活

H Hirochika公司等。植物细胞. 2000年3月.

.2000年3月；12(3):357-69.

doi:10.1105/tpc.12.3.357。

作者

H Hirochika公司¹, H冈本, T卡库塔尼

附属

¹日本茨城筑波国家农业生物资源研究所分子遗传学系，邮编：305-8602。

PMID： 10715322
预防性维修识别码：项目经理139836
内政部： 10.1105/tpc.123.357

摘要

许多真核生物，包括植物，都报道了与重复DNA序列相关的基因沉默。然而，其生物学意义尚待确定。已经提出的一个重要功能是抑制转座子。在这里，我们通过检测烟草反转录转座子Tto1和拟南芥内源性反转录转位子的行为来解决转座子抑制问题。由于拟南芥基因组中的主动转位，拷贝数最初增加后，Tto1变得沉默。转录物数量减少，失活的Tto1甲基化。这种沉默与拷贝数的增加有关。这些现象模拟了重复诱导的基因沉默。拟南芥的纯合ddm1（用于DNA甲基化降低）突变导致基因组DNA低甲基化和重复基因沉默的释放。为了研究DNA甲基化和基因调控机制在抑制T_1中的作用，我们将ddm1突变引入携带失活T_1拷贝的拟南芥系。在纯合ddm1背景下，Tto1发生了低甲基化，转录和转座活性。此外，一个新分离的内源性拟南芥逆转录转座子家族，命名为Tar17，在ddm1突变背景中也变得低甲基化和转录活性。我们的结果表明，反转录转座子的失活和重复基因的沉默有共同的机制。

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数字

**图1。**
转座子的DNA凝胶印迹分析*第1天*转基因拟南芥系。**（A）**和**（C）**五个独立T的分析₀转基因株系。**（B）**和**（D）**T的分析₁一个T的后代₀线路（车道4英寸**[A]**). 基因组DNA用EcoRV消化并与*第1天*-堵住探针(**[A]**和**【B】**)或一个*高压变压器*探针(**[中]**和**【D】**). DNA长度标记显示在左侧，单位为千碱基。

**图2。**
转座子的PCR分析*第1天*单位：T₀转基因系。**（A）**转位过程和转位后5′缺失序列的恢复。的衍生物*时间1-1*在5′端有一个36-bp的缺失(*T至1*【−36】）插入载体质粒的T-DNA区域，产生pBIT1（−36）。在转基因株系中，5′缺失的序列有望在转座期间通过RNA恢复*第1天*使用引物1和2复制，因为引物1与删除的序列同源。LTR，长端子重复。**（B）**PCR分析结果。五个T₀对图1A中使用的转基因株系和用载体质粒（pBI101-Hm）转化的对照转基因株系进行PCR分析。携带质粒*第1天*（−36），pSKTto1（−39），也用作对照。M、 HincII将φX174作为长度标记。

**图3。**
组织培养对转基因系后代转座的影响。混合子代的下胚轴切片（10 T₂每个T的植物₁工厂），共三T₁从一个T衍生的植物₀将品系（图1B，车道2、4和5）培养在愈伤组织诱导培养基上。从T制备基因组DNA₁植物（T₁)和再生植物（T₂再生）用EcoRV消化诱导的愈伤组织，并用*Tto1堵塞*探查。DNA长度标记显示在左侧，单位为千碱基。

**图4。**
DNA甲基化分析*第1天*单位：T₀，T型₁、和T₂转基因系。**（A）**的限制地图*时间1-1*以及用于分析的探针。黑色矩形表示长端子重复。**（B）**甲基化的DNA凝胶印迹分析*第1天*在拷贝数高的转基因株系中。用HpaII或MspI消化基因组DNA，并用*Tto1塞子*探查。T型₂从汇集的后代（四个再生T₂每个T的植物₁图3中使用的设备）。T型₁从汇集的子代（5 T）中制备DNA₁植物）源于每个T₀行。**（C）**甲基化的DNA凝胶印迹分析*第1天*在低拷贝数或中拷贝数的转基因系中。基因组DNA用HpaII消化并用DNA凝胶印迹分析*Tto1塞子*探查。T型₁从汇集的后代（10 T）中制备DNA₁植物）源于每个T₀行。的副本编号*第1天*在转基因株系中（从左到右）有六个、两个、一个和一个（数据未显示）。只有最左边的转基因系携带转座拷贝（四个拷贝）。所有DNA样本在**（B）**和**（C）**通过用一个单拷贝序列重制印迹，证明用限制性内切酶同样能很好地消化（m105；Pruitt和Meyerowitz，1986）（数据未显示）。非甲基化物消化预期碎片的长度和位置*第1天*显示在中的右侧**（B）**和**（C）**以千为单位。

**图5。**
DNA甲基化分析*第1天*野生型和*ddm1型*突变体。从两个T制备基因组DNA_三植物（T_三; 第121和122行），以及来自F的_三 *ddm1型*/*ddm1型*(*ddm1型*; 第119和120行）和*DDM1（DDM1）*/*DDM1（DDM1）*(*DDM1（DDM1）*; 第123和124行）族（来自交叉T₂工厂[*T1至DDM1*] × [*ddm1型*])用EcoRV消化，并用*Tto1塞子*探查。通过用图4图例中讨论的单拷贝序列重制印迹，发现所有DNA样品都被限制性内切酶同样很好地消化了（数据未显示）。DNA长度标记显示在左侧，单位为千碱基。右边显示了碎片的预期长度，单位为千基。

**图6。**
分析*第1天*野生型和*ddm1型*突变体。总RNA是从T的整株植物或愈伤组织中制备的_三植物（T_三; 第121和122行）和F_三 *ddm1型*/*ddm1型*(*ddm1型*; 第119和120行）和*DDM1（DDM1）*/*DDM1（DDM1）*(*DDM1（DDM1）*; 第123和124行）系列。作为对照，分析了烟草BY2细胞的总RNA（Nagata等人，1981年）。将20微克总RNA加载到凝胶上。

**图7。**
重新激活*第1天*由*ddm1型*愈伤组织突变。愈伤组织由F诱导_三 *ddm1型*/*ddm1型*(*ddm1型*; 第119和120行）和*DDM1（DDM1）*/*DDM1（DDM1）*(*DDM1（DDM1）*; 品系123和124）家系，培养3个月。将诱导的愈伤组织粉碎成块，然后分别培养一个月。用EcoRV消化每个愈伤组织的DNA，并用*Tto1塞子*探查。DNA长度标记显示在左侧，单位为千碱基。

**图8。**
线性分子的分析*第1天*在中*ddm1型*突变体。从F愈伤组织中制备的总DNA_三 *ddm1型*/*ddm1型*(*ddm1型*; 第119和120行）和*DDM1/DDM1*(*DDM1（DDM1）*; 用DNA印迹法对123和124）系家系进行无限制性消化分析*Tto1-gag*探查。线性*第1天*分子用箭头表示。M、 HindIII将λDNA作为长度标记。

**图9。**
内源性逆转录转座子转录的激活*柏油17*由*ddm1型*突变。**（A）**RNA凝胶印迹分析。从整株植物或愈伤组织中制备的总RNAddm1型/*ddm1型*(*ddm1型*)和*DDM1（DDM1）*/*DDM1（DDM1）*(*DDM1（DDM1）*)通过使用*Tto1塞子*探查。**（B）**底漆延伸分析。从整株植物中提取的10微克总RNA与5′末端标记的寡核苷酸杂交。用逆转录酶对杂交种进行扩增，并在测序凝胶上对cDNA产物进行电泳，同时使用相同的引物进行测序反应，如前所述（Hirochika，1993）。在中检测到一个带（由箭头指示）*ddm1型*仅突变体。**（C）**LTR的核苷酸序列*柏油17*由引物延伸决定的RNA用箭头表示。用于引物延伸分析的寡核苷酸的位置由箭头指示。

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