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.2000年2月21日；148(4):665-78.
doi:10.1083/jcb.148.4.665。

凝胶蛋白缺乏会阻碍足细胞组装，并导致骨量和强度增加

M Chellaiah女士 1, N Kizer公司, M Silva先生, U阿尔瓦雷斯, D Kwiatkowski先生, K A Hruska公司
附属公司

凝胶蛋白缺乏会阻碍足细胞组装，并导致骨量和强度增加

M Chellaiah先生等。 J细胞生物学. .

摘要

破骨细胞是一种独特的细胞，在运动过程中利用足小体而不是局部粘连进行基质附着和细胞骨架重塑。我们已经证明，骨桥蛋白（OP）与破骨细胞足小体的α（v）β（3）整合素结合，通过激活包括gelsolin、pp（60c-src）和磷脂酰肌醇3'-激酶在内的异多聚体信号复合物，刺激细胞骨架重组和骨吸收。在这里，我们证明了gelsolin-null小鼠中gelsolin缺乏阻断足小体组装和α（v）β（3）刺激的与运动相关的信号传导。凝胶素缺乏的破骨细胞由于肌动蛋白细胞骨架重塑延迟而运动能力低下。他们对自分泌因子OP没有反应，刺激了运动和骨吸收。凝胶素缺乏与正常骨骼发育和软骨内骨生长有关。然而，gelsolin-null小鼠的骺结构轻度异常，骺端小梁中保留软骨蛋白多糖，小梁厚度增加。随着年龄的增长，缺乏凝胶蛋白的小鼠表现出骨小梁和皮质骨厚度增加，产生机械性更强的骨骼。这些观察结果表明，gelsolin在足小体组装、细胞快速运动和通过α（v）β（3）整合素进行信号转导中发挥着关键作用。

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图1
图1
Gsn肌动蛋白细胞骨架的高倍检测+/+和Gsn−/−破骨细胞。将培养在玻璃盖玻片上的破骨细胞固定并用罗丹明-球蛋白染色。共聚焦显微镜检查细胞。Gsn的肌动蛋白细胞骨架−/−破骨细胞（下图）与Gsn相比有明显改变+/+单元（上部面板）。箭头表示放大后显示的细胞骨架区域（右侧、上部和下部面板）。棒材，100μm（左侧面板）；10μm（右侧面板）。
图2
图2
OP对肌动蛋白细胞骨架的影响。破骨细胞固定并用罗丹明-磷脂染色。显示了PBS或OP处理的细胞中的肌动蛋白丝组织。共聚焦显微镜检查细胞。显示了来自野生型（+/+）和无活性（−/−）小鼠的破骨细胞的肌动蛋白染色。
图4
图4
OP处理对Gsn中F-actin含量的影响+/+和Gsn−/−破骨细胞。野生型F-actin含量（Gsn+/+OP（Gsn）治疗使破骨细胞增加三倍+/+，操作）。在凝胶蛋白有效的细胞中没有观察到OP对F-肌动蛋白水平的影响（Gsn−/−、PBS和Gsn−/−，OP）破骨细胞。星号表示数据为平均值±SEM(n个= 3),P（P）< 0.001.
图5
图5
OP对凝胶蛋白相关蛋白磷酸化的影响。（A） 体外蛋白激酶试验，不以酪蛋白为外源底物，（B）以酪蛋白作为外源底物。分子量为125、85和60 kD的蛋白质磷酸化如A和B中的箭头所示。酪蛋白磷酸化如B中所示。OP处理可增加酪蛋白的磷酸化。（C） OP对凝胶蛋白相关PI3-K活性的影响。显示了TLC板的自射线照片。箭头所示为OP刺激磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PtdIns P3）的形成。治疗方法如下图所示。
图6
图6
Gsn中的Vinculin分布+/+和Gsn−/−破骨细胞。以Gsn为单位+/+破骨细胞，vinculin呈双排排列，靠近肌动蛋白环，如图所示，vincurin（+/+）之间的未染色环。在Gsn中观察到两种类型的vinculin分布−/−破骨细胞：在肌动蛋白网中混合的外围分布（中间板，+/+），或扩散分布（下部板，−/-）。
图7
图7
OP对Gsn运动能力的影响+/+和Gsn−/−破骨细胞。在体外吞噬（A）和触觉结合（B）试验中评估破骨细胞运动。OP增加Gsn的运动能力+/+破骨细胞在两种分析中都是原来的两倍以上，并且对Gsn的运动没有影响−/−破骨细胞。同样，卵黄凝集素（VN）刺激破骨细胞运动，而GRGDS和纤维连接蛋白（FN）没有影响。这些蛋白都没有刺激Gsn−/−破骨细胞活力。此外，在触觉定向分析中，Gsn−/−破骨细胞运动能力明显降低。A中的数据表示三种不同的破骨细胞制剂，每个实验是20-30个细胞轨迹的平均值。数据为平均值±SE。星号表示P（P）< 0.0001. B中的数据表示四种单独的破骨细胞制剂，每个实验条件下计算四个Transwell。星号表示P（P）< 0.01.
图8
图8
通过液泡H+ATP酶的分布检测破骨细胞质膜的极化。（A） 来自Gsn的破骨细胞的共焦显微镜−/−细胞。如反射光（红色）所示，在牙本质层水平处进行切片。箭头指向E11抗体检测到的H+ATP酶浓度区域。（B） H+ATP酶的浓度区域覆盖在破骨细胞产生的多眼吸收坑上。
图9
图9
Gsn破骨细胞的骨吸收活性+/+和Gsn−/−老鼠。如材料和方法所述，在牙本质切片上镀破骨剂，并在48小时后评估吸收坑的形成。在酸性苏木精染色的牙本质切片的低倍镜下，吸收坑被视为黑点，如A所示+/+加入破骨细胞（+/+）后，有大量的吸收坑，通过OP治疗，其大小和复杂性增加。在来源于Gsn细胞的破骨细胞中−/−小鼠（−/−），吸收坑很小，不受OP治疗的影响。（B） 凹坑的共焦图像。通过共焦显微镜评估个别再吸收坑的坑深（XZ）和坑面积（XY）。在牙本质切片中，Gsn−/−破骨细胞被钢板固定，凹坑深度减小。经OP治疗后，Gsn的凹坑深度显著增加+/+破骨细胞，但在含有Gsn的切片中不受OP的影响−/−破骨细胞。表中显示了来自三种破骨细胞制剂的多个牙本质切片上凹坑共焦显微镜的凹坑深度（XZ扫描）和凹坑面积（XY扫描）分组数据。
图10
图10
Gsn胫骨近端切片的组织形态计量学分析−/−和Gsn+/+老鼠。14周龄大鼠胫骨近端骨分离切片+/+（A和B）和Gsn−/−（C和D）小鼠用TRAP（A和C）或甲苯胺蓝（B和D）染色。（A和C）TRAP染色。+/+（A）和−/−小鼠（C）的原发性海绵体内和干骺端小梁表面均可见大量破骨细胞。−/−小鼠生长板下TRAP阳性破骨细胞的数量趋于增加，随着小梁从原发性海绵细胞（C）发育而来，出现双排细胞。−/−小鼠干骺端的小梁骨体积增加（箭头所示；比较A和C；见表）。（B和D）甲苯胺蓝染色。−/−小鼠（D）的干骺端小梁保留了软骨衍生蛋白聚糖。
图11
图11
Gsn股骨的机械强度+/+和Gsn−/−老鼠。（a） 四点弯曲测试生成的数据的图形表示。弯曲和位移相关线的斜率是刚度或刚度的反映，曲线下的面积是产生失效所需的能量。（b） +/-和−/-股骨的极限力矩-位移曲线。失效时的归一化位移（极限）在Gsn中更大−/−股骨（见表）。（c） 产生故障所需的能量在Gsn的股骨中更大−/−鼠标（见表）。
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