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.2000年2月7日；148(3):519-30.
doi:10.1083/jcb.148.3.519。

N-WASP募集对内切体和溶酶体的肌动蛋白依赖性推进

J汤顿 1, B A划船, M L考夫林, M Wu先生, R T月亮, T J米奇逊, C A拉拉贝尔
附属机构

N-WASP募集对内切体和溶酶体的肌动蛋白依赖性推进

J汤顿等。 J细胞生物学. .

摘要

我们研究了活爪蟾卵中肌动蛋白组装的时空控制。在卵子激活的几分钟内，富含肌动蛋白的彗尾出现在富含蛋白激酶C（PKC）的细胞质小泡子集上，导致小泡穿过细胞质。PKC激活剂佛波酯-肉豆蔻酸酯（PMA）刺激体内肌动蛋白彗星尾的形成，该过程可以在无细胞系统中重建。我们使用该系统定义了与肌动蛋白彗星尾相关的囊泡与提取物中其他囊泡的区别特征。我们发现，蛋白N-WASP被招募到与肌动蛋白彗星尾巴相关的每个囊泡的表面，这表明囊泡的运动是由肌动蛋白的直接下游靶点Arp2/3复合物核化的肌动蛋白集合引起的。运动小泡聚集吖啶橙染料，吖啶橙色是内体和溶酶体的标记。此外，电子显微镜显示，与肌动蛋白彗星尾相关的小泡具有多小泡内体的形态特征。哺乳动物细胞的内切体和溶酶体优先有核肌动蛋白组装，并在爪蟾卵提取系统中移动。这些结果将内体和溶酶体定义为肌动蛋白成核机制的募集位点，并证明肌动蛋白组装有助于细胞器运动。相反，通过使肌动蛋白成核组装，细胞膜可能有助于肌动蛋白细胞骨架的动态组织。

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数字

图1
图1
活化的肌动蛋白彗星尾形成爪蟾鸡蛋。（A） 鸡蛋的植物极，用玻璃微吸管刺动动物半球2分钟后。用扫描激光共聚焦显微镜观察到的卵子的这个区域尚未经历激活诱导的修饰。在质膜下方的分泌皮质颗粒（直径1-3μm的圆形阴影）中可以看到罗丹明-肌动蛋白和XPKCα-GFP的弥散分布。（B） 激活4分钟后，鸡蛋的同一区域。皮质分泌颗粒经历了胞吐，现在可以看到富含XPKCα-GFP（3-5-μm-直径）的较大小泡。当卵子达到最大收缩时，在囊泡中形成大量的罗丹明-肌动蛋白球形堆积物。（C） 卵子收缩后（激活后8分钟）的类似区域显示，XPKCα-GFP囊泡区域中有大量罗丹明-肌动蛋白彗星尾。这是一个切向光学截面，图像的最右边缘显示了鸡蛋表面的微绒毛尖端，左侧显示了鸡蛋皮层的更深区域。（D） 显示罗丹明-肌动蛋白彗尾诞生的时间序列（3.5秒间隔）。肌动蛋白组装似乎是由富含PKC的囊泡启动的，并最终影响囊泡10μm的位移。参见在线补充材料，视频1(http://www.jcb。org/cgi/content/full/148/3/519/DC1）。棒材：（A–C）10μm；（D） 5微米。
图2
图2
受精和PMA处理诱导的体内彗星尾形成。（A） 共焦图像画廊显示受精后8分钟固定的卵子中的肌动蛋白彗星尾巴。F-actin通过荧光素-类球蛋白染色显示。（B） 用2μM PMA治疗20分钟后，体内延时序列（16s间隔）显示罗丹明-肌动蛋白彗星尾巴（箭头所示）。参见视频2在线补充材料(http://www.jcb.org/cgi/content/full/148/3/519/DC1). 棒材，10μm。
图3
图3
体外重组PMA刺激的肌动蛋白组装。（A） 显示肌动蛋白彗星尾巴的时间序列爪蟾鸡蛋提取物。细胞溶胶中添加了粗膜组分、罗丹明-肌动蛋白和1μM PMA。在室温下孵育20分钟后，通过荧光显微镜（左侧）或相位对比显微镜（右侧；注意放大倍数较高）观察样品。箭头（左）表示彗星尾巴在移动。箭头（右下角）表示彗星尾部尖端有一个相位密集的粒子。（B） 在存在或不存在PKC抑制剂BIM-I（40μM）的情况下，进行如（A）所示的体外肌动蛋白组装反应。还提供了无PMA的对照反应的荧光图像。从十个随机场中采集低倍（20倍物镜）图像，其中两个场针对每种情况进行了描述。（C） B中所示数据的量化。在10个随机字段中，将背景以上荧光强度的像素总数相加。给出了三个实验的数据（平均值±SD）。棒材：（A）10μm；（B） 20微米。
图3
图3
体外重组PMA刺激的肌动蛋白组装。（A） 显示肌动蛋白彗星尾巴的时间序列爪蟾鸡蛋提取物。细胞溶胶中添加了粗膜组分、罗丹明-肌动蛋白和1μM PMA。在室温下孵育20分钟后，通过荧光显微镜（左侧）或相位对比显微镜（右侧；注意放大倍数较高）观察样品。箭头（左）表示彗星尾巴在移动。箭头（右下角）表示彗星尾部尖端有一个相位密集的粒子。（B） 在存在或不存在PKC抑制剂BIM-I（40μM）的情况下，进行如（A）所示的体外肌动蛋白组装反应。还提供了无PMA的对照反应的荧光图像。从十个随机场中采集低倍（20倍物镜）图像，其中两个场针对每种情况进行了描述。（C） B中所示数据的量化。在10个随机字段中，将背景以上荧光强度的像素总数相加。给出了三个实验的数据（平均值±标准差）。棒材：（A）10μm；（B） 20微米。
图3
图3
体外重组PMA刺激的肌动蛋白组装。（A） 显示肌动蛋白彗星尾巴的时间序列爪蟾鸡蛋提取物。细胞溶胶中添加了一种粗膜组分，罗丹明肌动蛋白和1μM PMA。在室温下孵育20分钟后，通过荧光显微镜（左侧）或相位对比显微镜（右侧；注意放大倍数较高）观察样品。箭头（左）表示彗星尾巴在移动。箭头（右下角）表示彗星尾部尖端有一个相位密集的粒子。（B） 在存在或不存在PKC抑制剂BIM-I（40μM）的情况下，进行如（A）所示的体外肌动蛋白组装反应。还提供了无PMA的对照反应的荧光图像。从十个随机场中采集低倍（20倍物镜）图像，其中两个场针对每种情况进行了描述。（C） B中所示数据的量化。在10个随机字段中，将背景以上荧光强度的像素总数相加。给出了三个实验的数据（平均值±SD）。棒材：（A）10μm；（B） 20微米。
图4
图4
PMA刺激N-WASP向与肌动蛋白彗星尾部相关的囊泡募集。无细胞小泡运动试验包含爪蟾将细胞液、细胞膜和1μM PMA固定在灌注室中，并用亲和纯化的抗-N-WASP抗体进行免疫标记，然后用德克萨斯红二级抗体和FITC-指骨肽进行免疫标记。75μM latrunculin A存在时出现N-WASP和F-actin募集，但未观察到彗星尾。ToxB处理阻止了N-WASP和F-肌动蛋白的募集，尽管在长时间暴露的情况下可以观察到固定膜的非特异性标记。棒材，5μm。
图6
图6
彗星尾部囊泡的薄片电子显微镜分析。将无细胞反应固定在灌注室中，并进行电子显微镜处理（见材料和方法）。收集了一组具有代表性的图像，以突出显示与尾部相关的小泡的奇怪形状、管状突起和多泡腔。请注意清晰的圆形轮廓和线粒体，它们都与彗星尾巴无关。条形，500 nm。
图5
图5
吖啶橙（内体和溶酶体的标记）在运动囊泡中的积累。在20μg/ml吖啶橙存在下，通过相位对比和荧光显微镜监测无细胞反应（不含罗丹明-肌动蛋白）。给出了三个实验中的合并图像（相位对比度和德克萨斯红滤光片集）的图库。80%与彗星尾部相关的小泡强烈积聚吖啶橙(n个=417彗星尾巴）。棒材，10μm。
图7
图7
肌动蛋白依赖的外源性内体推进爪蟾卵细胞溶质。用德克萨斯红转铁蛋白（40μg/ml）在37°C下处理HeLa细胞20分钟，并制备核后上清液（PNS）。PNS被稀释60倍爪蟾含有0.5μM Alexa（488）-actin和1μM PMA的卵胞浆。每10秒采集一次Alexa（488）和德克萨斯红外荧光图像。与肌动蛋白彗星尾巴相关的大约一半囊泡含有内化的德克萨斯红转铁蛋白。Bar，5μm。
图8
图8
内切体和溶酶体优先使肌动蛋白组装成核并在体外移动。HeLa核后上清液由未标记的细胞（A和D）和在37°C（B）或4°C（C）下用德克萨斯红转铁蛋白处理的细胞制备而成。固定并处理无细胞运动反应，以进行细胞器标记（红色）的表观荧光检测。F-actin（绿色，A-D）用FITC-柱状体蛋白检测。（A） ER膜用亲和纯化的抗Sec61β抗体进行免疫检测，然后用德克萨斯红二级抗体进行免疫检测。（B） 通过在37°C下用德克萨斯红转铁蛋白标记细胞20分钟来检测早期和再循环内体。（C） 在4°C下用德克萨斯红转铁蛋白标记细胞20分钟，检测细胞膜。（D） 用抗Lamp-1 H4A3单克隆抗体和德克萨斯红二级抗体对溶酶体进行免疫检测。棒材，5μm。（E） 在a-D中描述的实验中，与标记囊泡相关的彗星尾的定量。这个n个值是指在8–10个随机域中每个条件下计算的actin彗星尾巴总数。
图8
图8
内切体和溶酶体优先使肌动蛋白组装成核并在体外移动。从未标记的细胞（A和D）和在37°C（B）或4°C（C）下用德克萨斯红转铁蛋白处理的细胞中制备相同的HeLa核后上清液。固定并处理无细胞运动反应，以进行细胞器标记（红色）的表观荧光检测。F-actin（绿色，A-D）用FITC-柱状体蛋白检测。（A） 用亲和纯化的抗Sec61β抗体和德克萨斯红二级抗体对ER膜进行免疫检测。（B） 通过在37°C下用德克萨斯红转铁蛋白标记细胞20分钟来检测早期和再循环内体。（C） 在4°C下用德克萨斯红转铁蛋白标记细胞20分钟，检测细胞膜。（D） 用抗Lamp-1 H4A3单克隆抗体和德克萨斯红二级抗体对溶酶体进行免疫检测。棒材，5μm。（E） 在a-D中描述的实验中，与标记囊泡相关的彗星尾的定量。这个n个该值是指在8–10个随机场的每种条件下计数的肌动蛋白彗星尾的总数。
图9
图9
描述与肌动蛋白彗星尾部相关的N-WASP免疫金标记HeLa囊泡的电子显微照片画廊。将含有未标记HeLa膜的无细胞运动反应固定在灌注室中，用亲和纯化的N-WASP抗体进行免疫标记，然后用15nm蛋白A-金进行免疫标记并进行电子显微镜处理。彗星尾部偶尔可见金颗粒，但绝大多数与膜有关。注意囊泡形态与爪蟾卵泡如图6所示。条形，200 nm。
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