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.2000年1月4日；97(1):320-4.
doi:10.1073/pnas.97.1.320。

致癌LIM-only转录因子Lmo2调节小鼠血管生成，但不调节血管生成

Y山田 1, R Pannell公司, 福斯特, T H拉比茨
附属机构

致癌LIM-only转录因子Lmo2调节小鼠血管生成，但不调节血管生成

Y山田等。 美国国家科学院程序. .

摘要

在人类T细胞急性白血病中，LMO2基因被染色体易位激活，但在小鼠胚胎发生中，LMO2对卵黄囊的启动和最终造血至关重要。LMO2蛋白质包含两个LIM-zinc-finger-like蛋白质相互作用模块，并通过与DNA结合转录复合物中的特定伙伴相互作用发挥作用。我们现在通过跟踪小鼠嵌合体中Lmo2-null胚胎干（ES）细胞的命运，研究了Lmo2-associated转录复合物在血管系统形成中的作用。Lmo2在血管内皮中表达，Lmo2-null ES细胞在胚胎第9天左右正常参与毛细血管网络。然而，在此之后，在那些Lmo2-null ES细胞高表达的嵌合体小鼠中观察到血管系统的明显紊乱。此外，Lmo2-null ES细胞在胚胎第10天后不参与存活嵌合小鼠大血管壁的内皮细胞。这些结果表明，Lmo2对于中胚层的从头毛细血管形成是不需要的，但对于将现有毛细血管网络重塑为成熟血管系统是必要的。因此，Lmo2介导的转录复合物不仅调节造血的不同阶段，而且还调节血管生成，可能是通过Lmo2在不同环境中与不同伙伴的相互作用。

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图1
图1
Lmo2–lacZ同源重组敲除融合基因。本研究中使用了两种构建物来创建Lmo2靶向ES细胞。用pKO5-lacZ-neo转染CCB ES细胞(A类)筛选杂交检测靶向事件。最初分析了几个目标克隆，并根据其在小鼠胚泡注射后产生持续高水平嵌合体的能力选择了一个克隆（命名为KZ26）。KZ26克隆+/-用于第二次转染pKO5hygro（tk），研究了三个克隆（克隆1、16和64），其中Lmo2的第二个等位基因被靶向产生KZ26−/-(二氧化二铝−/−）ES细胞。(A类)建造Lmo2–lacZ通过克隆4.5kb钝端基因实现融合基因打靶载体Sfi公司I片段Sfi公司I-lacZ-MC1neopA（38）插入钝端巴姆基因靶向载体pKO5（tk）的HI位点（14）。在得到的克隆中，KO5-lacZ-neo是二氧化二铝（外显子2）与lacZ公司通过12bp的接头序列。描述了潮霉素靶向载体pKO5hygro（tk）和用于评估基因靶向的探针，如pKO5-lacZ-neo地图所示（14）。将pKO5-lacZ-neo瞄准二氧化二铝产生6-kb囊探针A的I片段（与9-kb种系带相比）和9.5-kb巴姆带有探针B的HI带（与12-kb生殖线带相比）。探针C是一个新探针，用于验证目标载体的单个插入。将pKO5hygro（tk）靶向二氧化二铝产生10.8-kb囊带探针A和13.8-kb的I波段巴姆带探头B.S的HI波段，囊我；B、，巴姆你好。(B类)用探针A（3′侧）、探针B（5′侧）和探针C（内部）的Southern过滤器杂交检测ES克隆DNA中的同源重组。显示了具有代表性的+/+（野生型）和+/-（新靶向）克隆的杂交。Wt，野生型杂交带。(C类)识别三个独立的双靶点二氧化二铝通过与探针A的过滤杂交获得−/−克隆（克隆1、16和64）。使用探针B和内部潮霉素探针（数据未显示）验证这些第二个靶向等位基因的完整性。
图2
图2
β-半乳糖苷酶染色法二氧化二铝+/−杂合胚胎。目标ES克隆KZ26（有一个空二氧化二铝等位基因）注射到胚泡中；获得嵌合小鼠，获得Lmo2空等位基因的种系传递。杂合KZ26小鼠与C57/BL6小鼠杂交，在E10.5和E12.5获得胚胎。这些胚胎用X-Gal染色作为β-半乳糖苷酶活性的底物。蓝色染色表示β-半乳糖苷酶区域由Lmo2–lacZ基因表达。(A类)E10.5胚胎。全身主要血管壁和毛细血管可见X-Gal染色。(B类)E12.5胚胎。除了血管系统的β-半乳糖苷酶染色外，在肢芽和尾端也发现了显著的染色。(C类)E12.5胚胎的组织切片经β-半乳糖苷酶染色并用曙红复染。在曙红染色的组织背景中可以观察到血管内皮细胞。(D类)E12.5胚胎肢芽的组织切片经β-半乳糖苷酶染色并用曙红复染。肢芽顶端外胚层脊下方的区域β-半乳糖苷酶阳性。
图3
图3
KZ26+/-和KZ26−/-嵌合体胚胎的全山X-Gal染色的比较。带有一个（KZ26+/-）或两个（KZ 26−/-）的ES细胞二氧化二铝将空等位基因注入C57/BL6囊胚并转移给受体雌性。在指定的胚胎期，切除胚胎并用X-Gal对其进行全山染色，以测试由以下因素引起的β-半乳糖苷酶活性：Lmo2–lacZ基因表达。(A类)E11.5 KZ26+/-嵌合胚胎，其染色模式与杂合KZ26小鼠的染色模式相似。(B类)E11.5来源于KZ26−/−克隆1的KZ26–/−嵌合体胚胎。在这个胚胎中，海马体和肢芽中可以看到ES细胞的贡献（蓝色），很少内皮细胞被染成蓝色（即ES细胞来源的内皮细胞）。(C类)E12.5 KZ26+/-嵌合胚。与E11.5 KZ26+/-胚胎一样，染色模式与杂合KZ26小鼠的染色模式非常相似。(D–F型)E12.5三个独立的−/−克隆的KZ26−/–嵌合胚胎。(D类)注射KZ26−/−克隆1获得的胚胎。(E类)克隆16的胚胎。(F类)克隆64的胚胎。在E11.5后的KZ26−/−嵌合体胚胎中，主要血管的内皮细胞中没有−/–ES细胞的作用，而海马、肢芽和尾部仍保持表达。血管内皮中ES的选择性缺失表明Lmo2蛋白在血管网络成熟（血管生成）中起着重要作用。
图4
图4
E10.5中血管系统的生长迟缓和紊乱二氧化二铝−/−嵌合体胚胎。通过注射KZ26+/-ES细胞产生嵌合胚胎(A类)或KZ26−/−ES细胞（克隆1）(B–J类)在E10.5时获得胚胎。胚胎接受全山X-Gal染色。图中显示的胚胎B–J类都是小伙伴。大小和X-Gal染色的差异表明ES细胞贡献的大小和水平之间存在反向关系，因为较高嵌合体（即β-半乳糖苷酶染色水平较高的嵌合体）生长迟缓。(A类)E10.5 KZ26+/-嵌合胚。这张照片是一个具有代表性的胚胎，幼崽之间没有明显的大小差异。(B–J)KZ26−/−嵌合体胚胎的一系列全山X-Gal染色。发件人A类到H（H），放大率相同。(J)胚胎的放大图（≈×1.7）如所示D类显示了高嵌合体−/−胚胎血管系统的主要紊乱。与KZ26+/-胚胎不同，未发现成熟血管(A类). 图中所示的−/−嵌合体胚胎的组织切片D类X-Gal染色，曙红复染。
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