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.1999年12月15日；13(24):3244-58.
doi:10.1101/gad.13.24.3244。

果蝇抑癌基因PTEN通过拮抗Chico/PI3-激酶信号通路控制细胞大小和数量

D C戈伯丹 1, N帕里西奥, E C古德曼, Mlodzik先生, C威尔逊
附属公司

果蝇抑癌基因PTEN通过拮抗Chico/PI3-激酶信号通路控制细胞大小和数量

D C戈伯丹等。 基因开发. .

摘要

人类肿瘤抑制基因PTEN编码一个假定的细胞骨架相关分子，具有蛋白磷酸酶和磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP3）3-磷酸酶活性。在细胞培养中，该蛋白的脂质磷酸酶活性参与调节细胞增殖和存活，但PTEN抑制体内肿瘤发生的机制尚未完全确定。在这里，我们表明高度进化保守的果蝇PTEN同源物DPTEN通过减少细胞大小和数量抑制苍蝇的增生性生长。我们证明，DPTEN通过拮抗果蝇I类磷脂酰肌醇3-激酶Dp110及其上游激活物Chico（胰岛素受体底物同源物）调节组织质量。令人惊讶的是，尽管DPTEN通常不影响细胞命运的决定，但它似乎确实在多种细胞类型中调节肌动蛋白细胞骨架的亚细胞组织。从这些数据中，我们认为DPTEN在调节组织和体型方面具有复杂的作用。它与Dp110相反，控制细胞数量和生长，同时通过其对肌动蛋白细胞骨架的影响协调影响细胞外围的事件。

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数字

图1
图1
的分子特性DPTEN公司. (A类)染色体定位DPTEN公司. TheDPTEN公司基因位于包含基因的基因座中第二条染色体上的31B/C德罗尔（Wilson等人，1993年），bsk/DJNK公司（Riesgo-Escovar，1996年；Sluss等人，1996年），以及奇科（Böhni等人，1999年）。在我们的分析中，我们使用了三个缺陷，这三个缺陷是由于P元素的不精确切除导致的奇科[财务报表（2）41; 见Sluss等人，1996年；Böhni等人，1999年]。干膜厚度（2L）41C删除德罗尔基因；这种缺陷的纯合胚胎不能表达德罗尔成绩单（未显示数据），表示其为空德罗尔EMS诱导的突变DPTEN公司地图接近德罗尔因为它们无法弥补最大的不足，直径（2L）170B，但补足干膜厚度（2L）41C和干膜厚度（2L）147F图中还显示了本研究中使用的基因组拯救构建体vivI的范围。限制性酶位点：巴姆HI（B）；生态RI（E）；欣dIII（H）；萨尔本人（S）；Xba公司I（X）。(B类)的顺序DPTEN公司基因组位点。倍数比较DPTEN公司cDNA克隆表明DPTEN公司该基因编码至少2.2kb（大写核苷酸）的转录本，包含509个氨基酸的ORF（核苷酸序列下方用粗体表示；终止密码子用星号表示）。最长cDNA的第一个核苷酸被指定为核苷酸1。转录单元被11个内含子（小写核苷酸）中断，所有内含子都包括5′供体和3′受体剪接连接的共有序列（Mount 1982）。在ORF的前八个残基中发现了两个蛋氨酸残基。在所有三个阅读框中，氨基末端蛋氨酸前面都有终止密码子（下划线），很可能是翻译起始点，因为它符合翻译起始共识（[C/A]AA[C/A]ATG；Cavener 1987），除了ATG的5′处直接插入了一个额外的T外，在无眼的基因（Quiring等人，1994年）。共有多聚腺苷酸化信号位点（位置4168；下划线）位于polyA尾部上游约30个碱基（在不同cDNA中位于位置4197或4203；延伸转录中的其他碱基以斜体表示）。一些cDNA和基因组序列存在多态性缺失；从位置3001到3009（粗体），它们缺少九个核苷酸。所有其他多态性均不影响编码的DPTEN蛋白；它们也以粗体显示（另请参见材料和方法）。一个cDNA（克隆6C）来源于交替剪接的信使核糖核酸（图1A中的虚线；在核苷酸3124和4016之间产生剪接融合），该信使核糖核酸缺乏外显子11序列（核苷酸3397-3609），因此编码一种在其羧基末端含有额外5个氨基酸（斜体）的蛋白质。
图2
图2
PTEN蛋白家族。预测的DPTEN蛋白与人类PTEN进行了比较（hPTEN；Steck等人，1997；Li等人，1997年a），秀丽隐杆线虫PTEN（DAF-18；省略了965-氨基酸蛋白质的羧基末端部分；Ogg和Ruvkun 1998）和酵母PTEN同源物TEP1（yTEP1或YNL128W；Li等人1997年b）。相同的氨基酸以黑色表示，保守的变化以灰色表示。张力域的范围用箭头标出。强调了该结构域中磷酸酶活性所需的三个区域，包括高度保守的磷酸酶特征基序（粗体下划线；Myers等人，1997年）。在癌症或显性遗传疾病中发现的错义突变的位置用星号标记（Maehama和Dixon，1999年）。除一种外，所有受影响的残留物在DPTEN中都是相同的。序列上方的交叉突显出PTEN特异性氨基酸，这些氨基酸在磷酸酶或张力蛋白家族的其他已知成员中未发现。
图3
图3
DPTEN公司调节成人眼睛的发育。光显微照片(A类)和扫描电子显微照片(B–F类)纯合子眼克隆DPTEN公司1(A、 C–F类)和直径（2L）170B(B类). 与杂合组织相比（白色箭头A–D)，突变区域（黑色箭头；inA类，突变区域是不表达w个+基因）包含扩大的小腿面和多达四个小腿间鬃毛的异常簇（在高倍镜下观察E类). 突变克隆中的小蜂数量也比相邻的野生型双生点中的多（深色区域表达两个拷贝的小蜂w个+基因；用黑色箭头标记A类). 猪鬃的厚度、形态和长度不均匀(D–F型; 中较短E类，在F类). 这些鬃毛内肌动蛋白束的排列异常(F类). 苍蝇的基因型为年,w、 hsFLP1；DPTEN公司1，P[里+; hs–新；FRT]40A/P[里+; w个+]30C，P[里+; hs–新；FRT]40安(A、 C–F类)和年,w、 hsFLP1；Df（2L）170B，P[里+; hs–新；FRT]40A/P[里+; w个+]30C，P[里+; hs–neo；FRT]40安(B类).
图4
图4
DPTEN公司控制单元大小和架构。(A–C)包含克隆组织纯合子的眼睛横截面带DPTEN1染色体(A、 C类)和aw个+ DPTEN公司三染色体(B类). 在A类和C、 w个突变光感受器可以与其表型上的野生型色素邻接物区分开来（参见图3A）。相反，w个+突变色素细胞B类携带两份w个+因此，与表型上的野生型邻居相比，它们的色素更丰富。在A类和B类、突变组织（黑箭头）和正常杂合组织（白箭头）。虽然突变小蜂的极性基本上不受影响，w个感光细胞体(A类; 在这个样本中，杂合组织中只有低水平的色素）和w个+色素细胞(B类)缺乏DPTEN公司尺寸增大。还请注意突变的杆蛋白的椭圆形结构。突变型和表型野生型光感受器中的Rhabdomers分别用黑色和白色箭头标记C.混合基因型的多小眼畸形C结果表明，对大小和杆状体形态的影响是细胞自主的；这个插入图中显示了单个小眼（黑色箭头），其中存在的两个突变光感受器与两个表型野生型光感受者（白色箭头）一起标记。(D、 E类)含有纯合子克隆组织的翅膀直径（2L）170B(D类; 注意，这只苍蝇还携带DJNK公司基因组拯救构建物pWZ；Riesgo-Escovar等人，1996年）和DPTEN公司1(E类). 克隆被标记为分叉的突变（未着色区域）。突变细胞扩大，通常交叉静脉无法从野生型组织（白色箭头）延伸到突变区域（黑色箭头），尽管偶尔会观察到额外的交叉静脉（数据未显示）。少数突变细胞含有重复的翼毛（黑色箭头）。苍蝇的基因型为y、 w，hsFLP1；DPTEN公司1，P[里+; hs–neo；FRT]40A/P[里+; w个+]30C，P[里+; hs–新；FRT]40安(A、 C类),y、 w个,hsFLP1；P[里+; w个+]30C、DPTEN三,P[里+; hs–neo；FRT]40A/P[里+; hs–新；FRT]40安(B类),y、 带，hsFLP1,（f）第36页; Df（2L）170B，P[里+; hs–新；FRT]40A/P[f+]30B，P[里+; hs–新；FRT]40A；pWZ公司/+ (D类)和年,w、 hsFLP1，第页第36页; DPTEN公司1,P[里+; hs–新；FRT]40A/P[f+]300亿,P[里+; hs–新；FRT]40安(E类).
图5
图5
DPTEN对翅膀中的PI3-激酶Dp110起拮抗作用。(A–C)来自携带dpp–镀锌4只有驾驶员(A类)，或表达一种激酶头，显性负形式的第110页,第110页D954A型(B类; Leevers等人，1996年），或野生型DPTEN公司(C)在…的控制下dpp–GAL4（Staehling-Hampton和Hoffmann 1994），在翼脉LIII和LIV之间表达GAL4（箭头；翼脉LI到LV标记在A类). 这些翼脉之间的面积（称为区域I）在这两种情况下都减少了约25%B类和C（见表1）。(D–F型)单独携带MS1096驱动程序的苍蝇翅膀(D类)或表达第110页D954A型由MS1096驱动程序控制(E、 F类)GAL4在翅膀中表达，特别是在背部表面（Leevers等人，1996年；Capdevila和Guerrero，1994年），从而减少了E类超过30%。在F类，苍蝇也是杂合子DPTEN公司1，部分抑制该表型。机翼面积比E类25%抑制减少的翅膀表型（见材料和方法）。苍蝇的基因型为w；Sp公司/+;P[周+; dpp–GAL4]/+ (A类),w；P[周+; UAS–第110页D954A型]/P[周+; dpp–GAL4](B类),w；P[周+; UAS–DPTEN（FF20.2）]/Sp；P[周+; dpp–GAL4]/+ (C),w个,P[周+; MS1096–镀锌4]/w(D类),w、 P[周+; MS1096–GAL4]/w；P（w）+; UAS–第110页D954A型]/+ (E类)、和w、 P[周+; MS1096–GAL4]/w；DPTEN公司1/+;P[周+; UAS–第110页D954A型]/+ (F类).
图6
图6
DPTEN公司完全抑制过度表达的促生长活性第110页在机翼上。苍蝇携带的翅膀英语–GAL4只有驾驶员(A类)或过度表达第110页(B类),DPTEN公司(C)或两者兼而有之第110页和DPTEN公司(D类)低于en–GAL4/UAS控制机翼后部。隔室边界位于LIV正前方；因此，后室包括翼静脉LIV和LV（标记于A类并在其他面板上用箭头标记）。尽管Dp110过度表达产生的翅膀皱缩变形，但值得注意的是，与前房相比，其后房扩大，这是LIV和LV之间最明显的表现，在过度表达DPTEN和DPTEN与Dp110联合表达的果蝇中，该区域减少。苍蝇的基因型为w；P[周+; 英语–GAL4]/+ (A类),w；P[周+; UAS–Dp110]/P【w+; 英语–GAL4](B类),w；P[周+; UAS–DPTEN]/P【w+; 英语–GAL4](C)、和w；P[周+; UAS–第110页]，P[w+; UAS–DPTEN]/P【w+; 英语–GAL4](D类).
图7
图7
DPTEN公司影响发育中眼睛肌动蛋白细胞骨架的亚细胞定位。面板显示了第三颗恒星幼虫眼睛成像盘的共焦显微照片，其中包含DPTEN公司1克隆。前部是左边在所有面板中。突变区域的标志是没有lacZ公司(A、 B类)或GFP(C、 D类)表达式(lacZ公司-GFP阳性组织显示为红色），而肌动蛋白元件则由肌动蛋白结合分子指骨样蛋白（与FITC偶联A类和B类和罗丹明C和D类; 所有面板均为绿色）。覆盖显示在左边侧面。白色箭头(A–C)指向突变区域，它不会被染成红色(A类)含有两个未结合细胞的突变克隆的眼盘，位于(左边半个面板）和形态发生沟（黑色箭头）内，以及发育中的commatidial前簇内的后细胞。发展中的商业集群中的肌动蛋白元素在B类.两者A类和B类显示堆叠共焦切片，扫描感光体顶端半部分～5μm的深度。与表型上的野生型相邻细胞相比，突变细胞的肌动蛋白微丝分布发生了改变，即在发育中的社区簇中，如B类，在突变细胞中有一个更复杂的微丝网络。C和D类分别显示大屏幕的低倍和高倍视图DPTEN公司克隆。中的注释C，野生型双斑点中的细胞数量减少（亮红色细胞标有白色箭头），装箱区域扩大D.D.迪拉姆显示了与野生型组织相比，顶端细胞骨架和相邻微丝的组织结构发生了改变（顶端投影用白色箭头标记）。在某些情况下，同一簇内的野生型和突变型光感受器（用白色箭头标记）似乎分别显示正常和突变表型。
图8
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Dp110和DPTEN拮抗作用模型示意图果蝇属增长控制。在哺乳动物中，果蝇属、和秀丽隐杆线虫PI3-激酶活性由包括胰岛素受体和IRS1-4的信号级联调节（Chen等人，1996年；Maehama和Dixon 1998年；Ogg和Ruvkun 1998年；Böhni等人，1999年）。小鼠中该途径的中断（Baker等人1993；Liu等人1993）和果蝇属（Böhni等人，1999）已经表明胰岛素受体信号控制组织和身体大小。我们的数据表明，DPTEN可拮抗苍蝇的这一途径，并减少细胞大小和数量。似乎DPTEN的影响主要是通过降低PIP3水平及其假定下游靶点（包括Dakt1）的活性来介导的。然而，DPTEN的蛋白磷酸酶活性也可能发挥作用（见Gu等人，1999年）。DPTEN似乎还通过目前尚未表征的机制（虚线）调节肌动蛋白细胞骨架的组织，这些机制可能涉及其蛋白质或脂质磷酸酶活性。DPTEN对细胞骨架的影响可能通过调节细胞扩散和侵袭性等过程影响其抑瘤活性。
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