Cingulin contains globular and coiled-coil domains and interacts with ZO-1, ZO-2, ZO-3, and myosin

doi:10.1083/jcb.147.7.1569

.1999年12月27日；147(7):1569-82.

doi:10.1083/jcb.147.7.1569。

红蛋白包含球状和卷曲状结构域，并与ZO-1、ZO-2、ZO-3和肌球蛋白相互作用

M科尔登尼¹, F D’Atri公司, E哈马尔, D A招架, J肯德里克·琼斯, D海岸, S花旗

附属公司

PMID： 10613913
PMCID公司： PMC2174252型
内政部： 10.1083/jcb.147.7.1569

红蛋白包含球状和卷曲状结构域，并与ZO-1、ZO-2、ZO-3和肌球蛋白相互作用

M科尔登尼等。 J细胞生物学. 1999.

.1999年12月27日；147(7):1569-82.

doi:10.1083/jcb.147.7.1569。

作者

M科尔登尼¹, F D‘Atri酒店, E哈马尔, D A招架, J肯德里克·琼斯, D海岸, S花旗

附属

¹意大利帕多瓦35121，帕多瓦大学生物系。

PMID： 10613913
PMCID公司： PMC2174252型
内政部： 10.1083/jcb.147.7.1569

摘要

我们描述了扣带蛋白的序列和蛋白质相互作用，扣带蛋白是一种位于上皮紧密连接（TJ）细胞质表面的M（r）140-160-kD磷酸蛋白。全长非洲爪蟾扣带蛋白cDNA的衍生氨基酸序列显示球形头部（残基1-439）和尾部（1326-1368）结构域和中央α-螺旋杆结构域（440-1325）。序列分析、电子显微镜和下拉分析表明，扣带蛋白棒负责形成线圈-线圈平行二聚体，其可通过分子间相互作用进一步聚集。来自上皮细胞、昆虫细胞和网织红细胞裂解物的下拉分析显示，扣带回蛋白（1-378）的NH（2）末端片段在体外与ZO-1（K（d）约5nM）、ZO-2、ZO-3、肌球蛋白和AF-6相互作用，但不与症状蛋白相互作用，并且COOH末端片段（377-1368）与肌球蛋白和ZO-3相互作用。ZO-1和ZO-2免疫沉淀物含有扣带蛋白，表明体内相互作用。全长扣带蛋白（而非NH（2）末端和COOH末端片段）与转染MDCK细胞中的内源性扣带蛋白共定位，这表明TJ定位需要头部和杆结构域内的序列。我们认为扣带蛋白是TJ的一个重要功能成分，将TJ的膜下斑块结构域与肌动球蛋白细胞骨架联系起来。

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数字

图1
的核苷酸和衍生氨基酸序列*非洲爪蟾*扣带蛋白。单下划线表示核定位序列。虚线下划线表示预测的线圈序列。这些序列可从GenBank/EMBL/DDBJ获得，注册号为AF207901。

图4
纯化鸡扣带蛋白棒的电镜分析。（A）扣带蛋白棒的旋转阴影分子。箭头表示一个130纳米长、2纳米宽的分子示例。箭头表示一个明显的扣带蛋白低聚物示例。（B）带扣蛋白棒扭曲缠结，着色为阴性。扭曲缠结的平均长度为432±51纳米(n个= 36). 仅对孤立的骨料进行评分。棒材，150 nm。

图3
结构预测和领域组织*非洲爪蟾*扣带蛋白。（A）扣带蛋白的Kyte-Doolittle疏水性图。氨基酸位置显示在x轴上。（B）使用MacStripe程序对扣带蛋白进行线圈预测分析。值为1表示卷取线圈的概率最高。图上方的水平线表示七分位重复的七帧。（C）域组织示意图*非洲爪蟾*扣带蛋白（见图10）。（D）下拉分析中使用的GST融合蛋白结构图。（E）转染实验中使用的Myc-tagged扣带蛋白结构图。

图6
扣带蛋白与ZO-1、ZO-2、ZO-3、肌球蛋白、AF-6和辛皮素的相互作用。（A）使用细菌表达的扣带蛋白从上皮细胞裂解物中提取GST。MDCK细胞的Western blot在结合GST、GST-XC（1-378）或GST-XC（377-1368）的谷胱甘肽-脑葡萄糖珠亲和纯化后或亲和纯化前（裂解液）裂解产物。ZO-1、ZO-2和AF-6似乎仅与扣带蛋白NH相关₂-末端片段，肌球蛋白与NH结合₂-末端片段和COOH-末端片段，辛普利金与任何片段都不相关。（B）含放射性标记体外翻译蛋白的网织红细胞裂解物的GST下拉。放射自显影术³⁵S-标记的ZO-1、ZO-2、ZO-3和肌球蛋白，在谷胱甘肽-脑葡萄糖珠上亲和纯化后与GST（GST）、GST融合爪蟾扣带蛋白NH₂-末端片段（GST-XC（1-378））或COOH-末端片段（GSM-XC（377-1368））。ZO-1和ZO-2仅与NH相关₂-末端片段、ZO-3和肌球蛋白与NH结合₂-终端和COOH终端碎片。（C）扣带回与ZO-1和ZO-2的免疫共沉淀。使用抗腹股沟蛋白抗血清C532对人CaCo2培养上皮细胞Triton-soluble（CaCo-T）和SDS-soluble，CaCo-S）组分中的扣带蛋白进行Western blot分析。（左上）细胞提取物；（右上）用抗腹股沟液抗血清免疫沉淀后的提取物（IPα-cing）；（左下）用抗ZO-1抗体（IPαZO-1）免疫沉淀后的提取物；和（右下）用抗ZO-2抗体（IPαZO-2）免疫沉淀后的提取物。红蛋白(*M（M）* _第页在SDS可溶性部分的ZO-1和ZO-2免疫沉淀物中检测到140 kD）。多肽*M（M）* _第页在CaCo2裂解物的Triton可溶性部分中检测到的100–135 kD可能代表蛋白质水解降解产物。

图5
自我互动*非洲爪蟾*扣带蛋白。通过亲和纯化附于GST或GST-XC（377-1368）、GST-XC（1-378）或融合于人类ZO-1片段（氨基酸849–1060）（GST-HuZO-1（849-1060））的谷胱甘肽-脑葡萄糖珠，通过放射自显影术检测由体外转录/翻译产生的放射性标记全长扣带蛋白。检测到与扣带蛋白COOH末端片段有强相关性，与ZO-1片段或GST无相关性。左边的数字表示基于预处理标记迁移的近似分子大小（单位：千道尔顿）。

图7
小鼠ZO-1与扣带蛋白NH相互作用的定量分析₂-末端片段。（A）用抗ZO-1单克隆抗体R40.76免疫印迹分析对照Sf21细胞的裂解物、感染小鼠ZO-1杆状病毒的Sf21淋巴细胞的裂解物，以及在GST-XC（1-378）上附着的谷胱甘肽-脑葡萄糖珠亲和纯化后的相同裂解物。（B）考马斯染色凝胶显示，当增加Sf21裂解物的数量时，结合部分（顶部的数字表示在裂解物中存在的ZO-1总量）与附于谷胱甘肽-Sepharose的2.5μg GST-XC（1-378）孵育。（C）图中显示了作为Sf21裂解液中游离（总负结合）ZO-1函数的ZO-1结合量，以及相同数据的Scatchard图分析（插图）。每个点是两个不同实验的平均值。按照材料和方法中的描述测量裂解液中的总ZO-1量和结合分数。结合是饱和的，估计解离常数为～5 nM。

图7
小鼠ZO-1与扣带蛋白NH相互作用的定量分析₂-末端片段。（A）对照Sf21细胞的裂解物、感染小鼠ZO-1杆状病毒的Sf21细胞的裂解物以及在连接到GST-XC（1-378）的谷胱甘肽Sepharose珠上亲和纯化后的相同裂解物的抗ZO-1 mAb R40.76免疫印迹分析。（B）考马斯染色凝胶显示，当增加Sf21裂解物的数量时，结合部分（顶部的数字表示在裂解物中存在的ZO-1总量）与附于谷胱甘肽-Sepharose的2.5μg GST-XC（1-378）孵育。（C）图中显示了作为Sf21裂解液中游离（总负结合）ZO-1函数的ZO-1结合量，以及相同数据的Scatchard图分析（插图）。每个点是两个不同实验的平均值。按照材料和方法中的描述测量裂解液中的总ZO-1量和结合分数。结合是饱和的，估计解离常数为～5 nM。

图8
暂时转染MDCK细胞中扣带蛋白的定位。模拟转染的MDCK细胞（a和a′），或转染XC（1-1368）-myc（b和b′）、XC（1-378）-myc（c，c′，d和d′）或XC（377-1368）-myc（e，e′，f和f′）的MDCK细胞的双重免疫荧光染色，使用抗腹股沟蛋白抗血清C532，然后使用TRITC抗兔（a–f）和抗–myc 9E10抗体，然后是FITC抗小鼠（a′-f′）。当COOH末端片段存在于转染构建物中时，C532标记内源性扣带蛋白和转染的扣带蛋白。9E10标签表达扣带蛋白。用溶剂或仅用载体转染小鼠转染细胞。b中的单箭头（b′中的对应箭头）表示内源性和转染的扣带蛋白在两个细胞之间的连接区域中共存。b和b′中的双箭头表示连接处含有内源性扣带蛋白，但未转染扣带蛋白。c–f中的星号（c′–f′中对应的星号）表示核区域。d′、e和e′中的星号表示转染蛋白的细胞质标记。f和f′中的细箭头表示染色鲜艳的细胞质聚集体。棒材，10μm。

图9
扣带回的定位*非洲爪蟾*在pCS2中用扣带蛋白构建物微量注射早期胚胎后的胚胎（原肠期）。用抗腹股沟蛋白抗血清R902、FITC抗兔抗体（a和b）和9E10抗体、TRITC抗小鼠抗体（a′和b′）对模拟微注射胚胎（a和a′）或微注射XC（377-1368）-myc于pCS2（b和b’）的胚胎进行双重免疫荧光染色。a和b中的箭头（b′中对应的箭头）表示结合扣带蛋白免疫标记。b′中的星号（b′中对应的星号）表示转染蛋白的细胞质标记。b′中的星号表示核区域。请注意，XC（377-1368）–myc分布在细胞质中，在连接和核区域中不存在。c和d显示了一个胚胎的两个不同的焦平面（c，顶端；d，亚顶端），该胚胎微注射了不带Myc标记的扣带蛋白残基1-378（XC（1-378）），并用抗腹股沟蛋白抗血清R902染色，然后用TRITC-抗体染色₂-扣带蛋白的末端区域（Cordennsi等人，1997年），并识别内源性和转染的扣带蛋白。c中的白色箭头表示两个相邻的卵裂球的顶端结合带蛋白染色。d中的黑色箭头表示c中所示的同一卵裂球焦点下平面的核区域。d中的黑星表示细胞质。在光线背景下，b′和c中可见的黑点代表颜料颗粒。棒材，20μm。

**图10**
（A）这是一幅示意图，显示了扣带蛋白作为一个平行二聚体与球状结构域和卷曲结构域的假定组织。（B）不同的建议名称、大小和氨基酸边界爪蟾扣带蛋白区域。（C） NH GST融合蛋白的体外相互作用综述₂-末端（1–378）和COOH末端（377–1368）片段爪蟾扣带蛋白。正分数表示检测到的交互作用（+的数量与使用不同方法的信号的相对强度成比例），负分数表示未检测到交互作用。

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