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.2000年1月；20(2):672-83.
doi:10.1128/MCB.20.2.672-683.2000。

细胞周期蛋白D1需要通过激活的Neu进行转化，并通过E2F依赖的信号通路诱导

R J Lee先生 1, C阿尔巴尼塞语, M Fu先生, M D’Amico先生, B林, G渡边捷昭, G K Haines第三, P M西格尔, M C悬挂, Y雅顿, J M霍洛维茨, W J穆勒, R G佩塞尔
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细胞周期蛋白D1需要通过激活的Neu进行转化，并通过E2F依赖的信号通路诱导

R J Lee先生等。 分子细胞生物学. 2000年1月.

摘要

neu（c-erbB-2）原癌基因编码酪氨酸激酶受体，该受体在20%至30%的人类乳腺肿瘤中过度表达。在转基因小鼠中，野生型Neu过度表达或激活Neu突变体诱导的乳腺肿瘤和过度表达转化Neu的MCF7细胞中，cyclin D1蛋白水平升高。对MCF7细胞中12个Neu突变体的分析表明，特定的C末端自磷酸化位点和细胞外结构域在细胞周期蛋白D1启动子激活中发挥重要作用。NeuT诱导细胞周期蛋白D1涉及Ras、Rac、Rho、细胞外信号调节激酶、c-Jun N末端激酶和p38，但不涉及磷脂酰肌醇3-激酶。细胞周期蛋白D1启动子的NeuT诱导需要E2F和Sp1 DNA结合位点，并被显性负E2F-1或DP-1抑制。在Rat-1细胞中，细胞周期蛋白D1反义或显性负E2F-1结构抑制了Neu诱导的转化。细胞周期蛋白D1反义构建物阻断了NeuT转化乳腺癌细胞在裸鼠体内的生长。这些结果表明，E2F-1介导了细胞周期蛋白D1的Neu-signaling级联反应，并确定了细胞周期素D1是Neu诱导转化的关键下游靶点。

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图1
图1
细胞周期蛋白D1蛋白水平由Neu诱导。（A） NIH 3T3细胞系DHFR/G8（表达野生型Neu[NeuWt]）、B104-1-1（表达NeuT）和neu（新）ΔC-1（包含NeuT的羧基末端缺失）。α-管蛋白显示为蛋白质负荷控制。右图为Neu突变体的示意图，显示信号肽（SP）、富含半胱氨酸的结构域（CRD）、跨膜结构域（TM）、酪氨酸激酶（TK）和羧基末端（CT）。CT中显示了五个自磷酸化位点（P1到P5）。显示跨膜结构域（Glu664）内的突变。（B） 在扩增了Cyclin D1蛋白的人乳腺癌细胞系中评估其蛋白水平neu（新）（MDA-MB-453和BT-483）与野生型细胞的比较新的（MDA-MB-231和HBL-100）。细胞被剥夺血清（0.5%血清）24小时，然后参考血清（10%血清）0、4或8小时。显示Neu蛋白水平，用GDI印迹进行蛋白负荷控制。（C） Western blot检测转染NeuT表达载体的MCF7细胞内源性细胞周期蛋白D1，并与转染空表达载体盒进行比较。（D） MMTV的乳腺肿瘤-neu（新）通过Western blotting分析MMTV-NDL转基因动物的细胞周期蛋白D1蛋白水平（下表）。用细胞周期蛋白D1特异性抗体DCS-11进行细胞周期蛋白D1免疫复合物测定。GST-pRB底物的磷酸化由箭头指示（上面板）。NBE，正常乳腺上皮。（E） 每个肿瘤的相对细胞周期蛋白D1蛋白水平和激酶活性（MMTV-neu（新）蓝色和MMTV-NDL红色）。折叠诱导显示为与三个正常乳腺化验得出的平均值的比较，用虚线表示。（F） MMTV的代表性细胞周期蛋白D1免疫组化染色-neu（新）乳腺肿瘤，阳性肿瘤细胞呈棕色（顶部，黄色箭头），阴性细胞呈蓝色（红色箭头）。同一动物的正常乳腺显示细胞核周期蛋白D1很少阳性（底部）。
图2
图2
Neu刺激MCF7细胞中的cyclin D1启动子。（A） 用越来越多的Neu表达载体（pSV）转染−1745CD1LUC报告子2NeuT）注入MCF7细胞。荧光素酶活性（相对光单位）与等量控制载体盒诱导的活性一起显示。（B） Neu诱导细胞周期蛋白D1启动子而非细胞周期蛋白A启动子。用cyclin D1，c质粒进行共转染实验-福斯和与荧光素酶报告基因相关的cyclin A启动子。c-福斯还评估了与最小TATA盒相关的血清反应元件（SRE）。pSV诱导2显示NeuT。（C和D）编码不同的表达向量neu（新）先前描述的突变体的转化能力，评估了它们对MCF7细胞中cyclin D1启动子活性的影响。数据显示为括号中所示实验次数平均值的平均值±标准误差。wt，野生型。
图3
图3
抑制剂对细胞周期蛋白D1 NeuT诱导的影响。为了检测与细胞周期蛋白D1启动子Neu诱导相关的细胞内信号通路，使用NeuT表达载体将−1745CD1LUC报告子导入MCF7细胞。（A） 使用越来越多的显性负表达载体进行共转染实验，Neu诱导的启动子激活的抑制以活性百分比表示。对N17Ras、N17Rac或N19Rho的显性阴性突变体和等量的空表达载体盒的效果进行了比较。（B） MEK/ERK途径的化学抑制剂（PD098059）(n个=8）和p38通路（SB203580）(n个=8）加入培养基中，并与等体积的DMSO载体进行比较。编码JNK信号抑制剂（JIP-1）的表达载体(n个=4）与等量的空表达载体盒相比，显示了每种浓度的质粒。抑制作用在P（P）< 0.05.
图4
图4
参与细胞周期蛋白D1启动子Neu诱导的启动子序列。（A） 细胞周期蛋白D1启动子的示意图，其序列与E2F和Sp1结合位点同源。LUC，荧光素酶。（B） pSV公司2将细胞周期蛋白D1 5′启动子构建物转染NeuT至MCF7细胞。*代表与−163CD1LUC报告基因的显著差异P（P）< 0.05. （C） 编码与最小TK启动子相连的cyclin D1启动子E2F或Sp1位点的异源结构被pSV转染2NeuT进入MCF7细胞。比较了对最小TK报告者的影响。在每种情况下，折叠刺激都反映了NeuT与空表达载体盒的诱导，实验数量如括号所示。
图5
图5
Sp1/Sp3和E2F-1蛋白结合neu（新）细胞周期蛋白D1启动子的T反应元件。（A） 32P标记的细胞周期蛋白D1 Sp1样序列与MCF7细胞核提取物孵育，并测定同源竞争物（第2道）、野生型规范Sp1结合位点竞争物（第一道）和一个无关的寡核苷酸竞争物（四道）的100倍过量的影响。如车道（车道5至10）上方所示，添加针对Sp蛋白的特定抗体或等量的对照IgG（车道5）。箭头表示通过超移位或抑制DNA结合识别出的组成带（A到C）的预测蛋白质。（B） 含杆状病毒感染的Sf9细胞提取物的EMSA。这个32P标记的腺病毒E2F位点（1至4道）和野生型（5至8道）或突变型（9至10道）细胞周期蛋白D1 E2F位点与E2F和DP蛋白共同孵育，如上面所示。与腺病毒E2F位点相比，每条E2F-DP复合物的相对结合在每条通道下方。（C） CHIP分析使用−1745 CD1LUC MCF7细胞系或野生型MCF7电池（5至8区）进行。用细胞周期蛋白D1特异性引物在水（泳道2）、对照质粒（泳道3）或免疫沉淀缓冲液（泳道4）上进行PCR，或在甲醛交联的细胞提取物用IgG对照（泳道5和7）或E2F-1特异性抗体（泳道6和8）免疫沉淀后进行PCR。特异性细胞周期蛋白D1启动子带如箭头所示。
图6
图6
NeuT诱导E2F-1、Sp1和Sp3转录激活。在MCF7细胞中评估野生型E2F-1、E132突变体E2F-1，Y411C突变体E2F1和DP-1显性阴性突变体对NeuT诱导（A）或基础（B）细胞周期蛋白D1启动子活性的影响，并与各自空载体的影响进行比较。（C） 用细胞周期蛋白D1 5′启动子构建体将E2F-1表达载体转染MCF7细胞。*与−163CD1LUC报告者相比P（P）< 0.05. （D） GAL4构建物和异源荧光素酶报告子的示意图，其中包含GAL4 DNA结合域的五个上游激活物结合位点。记者（UAS）5用GAL4–E2F-1、GAL4-E2F-1（Δ413-417）（pRB结合缺陷型E2F-1突变体）、GAL4-Sp1、GAL-4-Sp3、PAG236和任一pSV的表达载体转染E1BTATALUC（2.4μg）2MCF7细胞中的NeuT（600 ng）或空表达载体盒。比较NeuT表达载体和等量亲本载体的效果。数据为平均折叠归纳法±括号中所示单独实验次数平均值的标准误差。
图7
图7
细胞周期蛋白D1反义抑制neu（新）-诱导焦点形成。在Rat-1细胞中使用NeuT进行转化分析。激活的NeuT突变体（2.5μg）单独或与列出的一个反义或显性阴性表达质粒一起引入。与空表达载体盒相比，评估细胞周期蛋白D1反义（pBPSTR-1CD1AS）（A）和N17Ras、N17Rac、N19Rho、MEKC和E2F-1（E2F-1 E132）（2.5或5μg）（B）的显性阴性突变体。NeuT载体与显性阴性或反义质粒的摩尔比分别为1:1和1:2时对转化的影响。A组显示了具有周期蛋白D1反义作用的代表性分析。NeuT诱导的转换显示为100%的黑色条。结果显示为与空向量盒的效果相比，独立转换分析中NeuT的转换百分比（平均值±平均值的标准误差）。
图8
图8
细胞周期蛋白D1反义抑制裸鼠NeuT转化乳腺上皮细胞的生长。免疫缺陷小鼠将转染的NAFA细胞皮下注射到PBS中的每个侧翼。注射转染对照载体NAFA的细胞的部位（右侧，黄色箭头）显示肿瘤发生，而在同一动物的左侧（红色箭头）注射转染细胞周期蛋白D1反义的NAFA细胞，没有显示肿瘤的发展。（A和B）两侧注射小鼠的两个例子；（C） 图A中小鼠右侧肿瘤的苏木精和伊红染色，显示腺癌；（D） 对A组小鼠移植细胞进行Western blot，结果显示与对照载体（对照）相比，转染细胞周期蛋白D1反义（CD1 AS）的细胞中的细胞周期蛋白D_1蛋白水平降低。GDI印迹证实了等效的蛋白质负荷，角蛋白-8印迹证实组织来源于上皮。
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