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.1999年11月29日；147(5):913-20.
doi:10.1083/jcb.147.5.913。

A型层粘连蛋白表达缺失损害核膜完整性，导致肌营养不良

T沙利文 1, D Escalante-Alcalde公司, H巴特, M Anver先生, N Bhat公司, K长岛, C L斯图尔特, B伯克
附属公司

A型层粘连蛋白表达缺失损害核膜完整性，导致肌营养不良

T沙利文等人。 J细胞生物学. .

摘要

核膜是内核膜核质面上的蛋白质网，是核间期结构的重要决定因素。其主要成分是A型和B型层粘连蛋白。尽管B型层粘连蛋白存在于所有哺乳动物细胞中，但A型层粘着蛋白的表达受发育调控。在小鼠中，直到胚胎发育中期，A型层粘连才出现，这表明这些蛋白可能参与了末端分化的调控。这里我们显示缺乏A型核纤层蛋白的小鼠发育到足月时没有明显异常。然而，他们出生后的生长严重迟缓，表现为肌肉营养不良。这种表型与核膜的超微结构扰动有关。这些包括emerin的定位错误，emerin是一种内核膜蛋白，其缺陷与Emery-Dreifuss肌营养不良（EDMD）有关，EDMD是三种主要的X连锁肌营养不良之一。缺乏A型层粘连蛋白的小鼠表现出其核膜完整性和emerin分布的组织特异性改变。在骨骼肌和心肌中，这表现为与EDMD相关的营养不良状态。

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数字

图1
图1
目标Lmna公司基因。（a） 鼠标的结构Lmna公司基因、靶向载体和含有PgkNeo公司磁带。（b） Southern分析Lmna公司杂合子杂交。（c） 来自野生型和Lmna公司空成纤维细胞显示缺失全长形式的层粘连蛋白A和C mRNA。这些被截断的转录本取代，其水平比野生型低10倍。（d） Western分析显示，所有三种基因型MEF核提取物的XB10抗体（针对层粘连蛋白A/C的中心结构域）表明，层粘连A和C蛋白在−/−成纤维细胞中无法检测到，而层粘连B水平则不受影响。P19 EC细胞作为阴性对照。（e） 使用肝细胞核和核膜的1E4抗体（针对层粘连蛋白A/C氨基末端区）进行的Western分析显示，如在MEFs不存在层粘连蛋白A的情况下。
图2
图2
野生型和Lmna公司无MEF。所有实验的细胞核均用DAPI标记；在a–d中，DAPI和免疫荧光图像被叠加。（a） 用XB10单克隆抗体检测板蛋白a和C。（b） 核膜相关蛋白LAP2。请注意，这种蛋白质在野生型核膜中分布均匀，但在Lmna公司空单元格。（c） 核孔复合体Nup153。与LAP2一样，核的一极也有损失，这表明NPC被排除在该区域之外。（d和e）层蛋白B。从细胞核的一极可以清楚地看到这种蛋白被排除在Lmna公司空单元格。在e中，显示层粘连蛋白B分布（lamin B*）的免疫荧光图像叠加在同一细胞的Nomarski图像上。请注意，e中的两个面板显示了相同的互补图像Lmna公司空单元格。下部面板仅显示DAPI标签。
图3
图3
MEF（a）和肝细胞（b）的电子显微镜分析。（a） 在野生型和杂合型MEF细胞核中，可以看到与核膜内表面接触的异染色质的大致连续层。在Lmna公司空核，这一层（橙色方框）中有明显的不连续性，与核膜的膨胀并列。（b） 在肝细胞核中可以看到类似的不连续性（箭头所示）。
图4
图4
组织的组织学和免疫组织化学分析Lmna公司使鼠标无效。（a） 野生型椎周肌显示肌纤维中核的周边定位。（b） 椎体周围肌肉Lmna公司null小鼠的细胞核数量增加，许多位于肌肉纤维中央（箭头所示）。（c） 野生型心室肌。（d） 心室肌Lmna公司空鼠标。（e和f）Emerin（上面板）在野生型（e）和层粘连−/−（f）小鼠骨骼细胞核中的定位。在−/−肌肉中，NE中emerin的信号强度弱于+/+细胞核。抗层粘连蛋白B标签不变（下部面板罗丹明标签）。（g和h）野生型（g）和核纤层蛋白−/−（h）小鼠。注意emerin在−/−心肌NE中的极性分布（箭头）。（i和j）舌上皮的Emerin染色。在野生型上皮中，emerin定位于NE是容易检测到的（i），而在层粘连蛋白缺失的小鼠中，它丢失了（j）。Nuclei i和j与DAPI协同。
图5
图5
（a） +/+、+/-和−/−中emerin（34 kD）和lamins a和C（分别为74和65 kD）的Western blot分析Lmna公司MEF显示不同基因型之间的emerin水平没有差异。（b） 在野生型细胞中，emerin仅局限于核膜。（c） 在杂合子中，可以在细胞质中检测到一些emerin定位。（d） 在层粘连A/C−/−细胞中，emerin主要是细胞质的，尽管核膜的某些定位仍然很明显。人层粘连蛋白A在Lmna公司零MEF导致emerin重新定位到核包层。（e） DAPI染色显示两个MEF的细胞核。（f） MEF上部表达人类层粘连蛋白A，仅定位于核膜。（g） 这两种细胞都表达emerin，但在层粘连蛋白A阴性细胞中，emerin主要定位于细胞质室，而在层粘着蛋白A阳性MEF中，emorin几乎完全定位于核膜。（h） 合并图像显示了核包膜中emerin和人类层粘连蛋白A的共定位。（i和j）Emerin在P19EC细胞中的分布（i）和（j）表达A型层粘连的分化衍生物P19MES。两种细胞类型都表现出NE相关的emerin。
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