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.1999年12月；73(12):9928-33.
doi:10.1128/JVI.73.12.9928-9933.1999。

猴病毒5的V蛋白通过靶向STAT1介导蛋白酶体降解抑制干扰素信号

L迪科克 1, D F Young公司, S古德本, R E Randall公司
附属公司

猴病毒5的V蛋白通过靶向STAT1介导蛋白酶体降解抑制干扰素信号

L迪科克等人。 J维罗尔. 1999年12月.

摘要

为了在体内复制，病毒必须绕过细胞抗病毒防御机制，包括干扰素（IFN）诱导的机制。在这里，我们证明猴病毒5（SV5）通过抑制IFN刺激的基因因子3和γ激活因子转录复合物的形成来阻断人细胞中的IFN信号传导，这两种转录复合物分别参与激活IFN-α/β和IFN-γ应答基因。SV5通过特异性靶向STAT1抑制这些复合物的形成，STAT1是两种转录复合物共同的成分，用于蛋白酶体介导的降解。在没有其他病毒蛋白的情况下，SV5结构蛋白V的表达也抑制了IFN信号传递并诱导STAT1的降解。感染SV5后，STAT1在没有病毒蛋白合成的情况下降解，感染后4天内无法检测到。此外，即使细胞处于抗病毒状态，干扰素预处理细胞中的STAT1也会降解。由于用干扰素对细胞进行预处理会延迟但不会阻止病毒复制和蛋白质合成，这些观察结果表明，在干扰素预处理的细胞感染后，SV5在细胞内仍能存活，直到它们最终脱离抗病毒状态。

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图1
图1
SV5抑制2fTGH细胞中IFN-α/β（a）和IFN-γ（b）信号传导以及ISGF3（c）和GAF（d）复合物的形成。用IFN-α/β（a）-或IFN-γ（b）-应答质粒和pJATlacZ转染细胞，转染后16 h，细胞被模拟感染或感染SV5。在24小时p.i.时，用rHuIFN-αA/D（A）或IFN-γ（b）补充培养基或不处理。4小时后，测量细胞裂解物中的萤光素酶和β-半乳糖苷酶活性。荧光素酶活性（以相对光单位表示）归一化为β-半乳糖苷酶活性。对于EMSA，用SV5模拟感染细胞或感染细胞24小时，然后用rHuIFN-αA/D（c）或rHuIFN-γ（D）处理细胞（+）或不处理细胞（-）1小时。提取液的制备和EMSA分析使用32P标记的ISRE（c）或GAS（d）探头。
图2
图2
STAT1（而非STAT2）在受SV5感染的人类细胞中降解。利用对STAT1（a）的C末端或STAT1的N末端或STAT2（C）的反应性抗体，通过免疫印迹分析在模拟或SV5感染的2fTGH细胞的全细胞提取物中检测STAT1和STAT2。应该注意的是，抗STAT1抗体都与STAT1α和STAT1β反应（在低百分比的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上可以更清楚地分辨它们）。模拟感染细胞和SV5感染细胞（b）中均存在较低的显著带，估计分子量为75kDa，尚未确定。
图3
图3
蛋白酶体抑制剂MG132阻断SV5感染的2fTGH细胞中STAT1的降解和TNF-α刺激的2fTGH细胞中IκBα的降解。从感染时起，在含有或不含有蛋白酶体抑制剂MG132（10μM）的培养基中培养模拟感染细胞（1道）和SV5感染细胞（2至5道）。在p.i.第8小时，培养基被（第3和第5道）或没有（第1、第2和第4道）进一步补充TNF-α；30分钟后，收集细胞，通过免疫印迹分析检测STAT1（a）和IκBα（B）的水平。
图4
图4
SV5的V蛋白诱导蛋白酶体介导的STAT1降解。（a） 2fTGH细胞被模拟感染（第1道）或感染recSFV/F（第2道）、recSFV/lacZ（第3道）或recSFV/V（第4道）8小时，如前所述，检测总细胞提取物中的STAT1。（免疫荧光分析证实，>95%的细胞在收获时表达了适当的病毒蛋白。）（b）2fTGH细胞被模拟感染（通道1和2）或感染recSFV/V（通道3和4）。在感染时，蛋白酶体抑制剂MG132（10μM）被添加到或未添加到培养基中（通道2和4）。在p.i.第8小时，收集细胞，并通过免疫印迹分析评估STAT1水平。
图5
图5
SV5的V蛋白（而非P蛋白）阻断人细胞中IFN-α/β应答启动子的激活。在单纯疱疹病毒TK启动子（a）或干扰素-α/β应答启动子（b；0.1μg）的控制下，用含有荧光素酶基因的质粒混合物和0.3μg的pEFlink2（对照）pEF转染2fTGH细胞。SV5-P（表达SV5-P蛋白）或pEF。SV5-V（表达SV5 V蛋白）。转染混合物中还包括0.1μg质粒pJATlacZ，其中lacZ公司该基因受大鼠β-actin启动子的控制。在转染后40 h，培养基中添加或不添加IFN。4小时后，测量细胞裂解液中的荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性。荧光素酶活性（以相对光单位表示）归一化为β-半乳糖苷酶活性。
图6
图6
在没有病毒蛋白合成的情况下，STAT1在SV5感染细胞中迅速降解。（a） 通过免疫印迹分析，对模拟感染（1区）或感染SV5 1、2、4或8小时（2至5区）的2fTGH细胞的总细胞提取物进行STAT1检测。（b） 2fTGH细胞被模拟感染（通道1）或感染紫外线激活的SV5（通道2-6）。在第6小时（通道1和2）和第24、48、72和96小时（通道3至6），通过免疫印迹分析检测总细胞提取物中的STAT1。（根据免疫荧光判断，在后一个实验的任何时候，细胞均未出现病毒抗原阳性。）
图7
图7
抑制转录和蛋白质合成并不能阻止SV5感染细胞中STAT1的降解。2fTGH细胞未经处理（Un）或用放线菌素D（Act.D；10μg/ml）或放线菌酮（Cx；50μg/ml。放线菌素D或环己酰亚胺（视情况而定）也存在于整个感染期。在p.i.6 h提取细胞总提取物，并通过免疫印迹分析检测STAT1水平。
图8
图8
干扰素预处理细胞中STAT1降解。在模拟感染（通道1和2）或SV5感染（通道3至6）之前，2fTGH细胞（通道2、通道4和通道6）或未（通道1、通道3和通道5）接受rHuIFN-αA/D治疗24小时。在p.i.第6小时（1至4车道）或第24小时（5和6车道）采集的细胞中提取总细胞提取物，并通过免疫印迹分析检测STAT1水平。
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