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。1999年10月15日；13(20):2678-90.
doi:10.1101/gad.13.20.2678。

Bmi-1通过INK4a/ARF抑制c-Myc诱导的凋亡，从而与c-Myc在肿瘤发生中协同作用

J·J·雅各布斯 1, B Scheijen先生, J W冯肯, K Kieboom公司, A伯尔尼, M van Lohuizen先生
附属公司

Bmi-1通过INK4a/ARF抑制c-Myc诱导的凋亡，从而与c-Myc在肿瘤发生中协同作用

J J雅各布斯等。 基因开发。 。

摘要

bmi-1和myc癌基因在小鼠淋巴腺病中密切合作，但这种合作的基础尚不清楚。我们最近确定ink4a-ARF肿瘤抑制基因座是多梳组转录抑制因子Bmi-1的关键下游靶点。其他研究表明，Myc诱导凋亡的部分能力取决于p19arf的诱导。在这里，我们证明Bmi-1下调ink4a-ARF是其与Myc协同肿瘤发生的基础。bmi-1杂合性通过增强c-myc诱导的细胞凋亡抑制Emu-myc小鼠的淋巴腺病。我们观察到bmi-1（-/-）淋巴器官的凋亡增加，这可以通过缺失ink4a-ARF或bcl2过度表达来挽救。此外，Bmi-1与Myc合作，通过抑制Myc介导的p19arf诱导和凋亡，以ink4a-ARF依赖性方式促进原代胚胎成纤维细胞（MEF）的增殖和转化。我们观察到Emu-myc转基因和ink4a-ARF杂合性之间的紧密协作，伴随着野生型ink4a-AFF等位基因的丢失和高度侵袭性B细胞淋巴瘤的形成。总之，这些结果加强了Bmi-1作为ink4a-ARF的剂量依赖性调节器的关键作用，后者反过来通过激活癌基因（如c-myc）来阻止肿瘤的发生。

PubMed免责声明

数字

图1
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杂合性bmi-1型导致对淋巴腺病的敏感性降低，c-Myc诱导的前B细胞扩张消失，c-Myc诱导的凋亡增加。(A类)MoMLV诱导的Eμ–肿瘤的Kaplan-Meier生存曲线myc公司，Eμ–myc；体重指数-1+/−，体重指数-1+/−、野生型对照小鼠和(B类)Eμ中自发（前）B细胞淋巴瘤myc公司和Eμ–myc；bmi-1型+/−老鼠。(C类)野生型骨髓细胞悬液的流式细胞仪分析，体重指数-1+/−，Eμ–myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−5-7周龄小鼠。B220细胞表面染色显示，由于Eμ–myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−小鼠和Eμ中前B细胞室的扩大myc公司但不在Eμ中myc；体重指数-1+/−老鼠。(D类)野生型Eμ–骨髓细胞悬液的流式细胞仪分析myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−小鼠，在不含特定生长因子的10%FBS/RPMI培养基中培养24小时，随后进行B220和Annexin-V染色+/附件蛋白-V−B220的+淋巴细胞表明骨髓来源的前B细胞的凋亡易感性。(E类)Annexin-V百分比分析+生存B220池中的细胞+/PI公司−淋巴细胞表明Eμ–myc；体重指数-1+/−小鼠与Eμ–myc公司老鼠。
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杂合性bmi-1型导致对淋巴腺病的敏感性降低，c-Myc诱导的前B细胞扩张消失，c-Myc诱导的凋亡增加。(A类)MoMLV诱导的Eμ–肿瘤的Kaplan-Meier生存曲线myc公司，Eμ–myc；体重指数-1+/−，体重指数-1+/−、野生型对照小鼠和(B类)Eμ中自发（前）B细胞淋巴瘤myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−老鼠。(C类)野生型骨髓细胞悬液的流式细胞仪分析，体重指数-1+/−，Eμ–myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−5-7周龄小鼠。B220细胞表面染色显示，由于Eμ–myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−小鼠和Eμ–myc公司但不在Eμ中myc；体重指数-1+/−老鼠。(D类)野生型Eμ–骨髓细胞悬液的流式细胞术分析myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−小鼠，在不含特定生长因子的10%FBS/RPMI培养基中培养24小时，随后进行B220和Annexin-V染色+/附件蛋白-V−B220的+淋巴细胞表明骨髓源性前B细胞的凋亡敏感性。(E类)Annexin-V百分比分析+生存B220池中的细胞+/PI公司−淋巴细胞表明Eμ–myc；体重指数-1+/−小鼠与Eμ–myc公司老鼠。
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杂合性体重指数-1导致对淋巴腺病的敏感性降低，c-Myc诱导的前B细胞扩张消失，c-Myc诱导的凋亡增加。(A类)MoMLV诱导的Eμ–肿瘤的Kaplan-Meier生存曲线myc公司，Eμ–myc；体重指数-1+/−，体重指数-1+/−、野生型对照小鼠和(B类)Eμ中自发（前）B细胞淋巴瘤myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−老鼠。(C类)野生型，体重指数-1+/−，Eμ–myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−5-7周龄小鼠。B220细胞表面染色显示，由于Eμ–myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−小鼠和Eμ中前B细胞室的扩大myc公司但不在Eμ中myc；体重指数-1+/−老鼠。(D类)野生型Eμ–骨髓细胞悬液的流式细胞术分析myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−小鼠，在不含特定生长因子的10%FBS/RPMI培养基中培养24小时，随后进行B220和Annexin-V染色+/附件蛋白-V−B220的+淋巴细胞表明骨髓源性前B细胞的凋亡敏感性。(E类)Annexin-V百分比分析+生存B220池中的细胞+/PI公司−淋巴细胞显示Eμ增加10倍myc；体重指数-1+/−小鼠与Eμ–myc公司老鼠。
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杂合性体重指数-1导致对淋巴瘤的易感性降低、c-Myc诱导的前B细胞扩增的消除和c-Myc诱导的细胞凋亡的增加。(A类)MoMLV诱导的Eμ–肿瘤的Kaplan-Meier生存曲线myc公司，Eμ–myc；bmi-1型+/−，体重指数-1+/−、野生型对照小鼠和(B类)Eμ中自发（前）B细胞淋巴瘤myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−老鼠。(C类)野生型骨髓细胞悬液的流式细胞仪分析，体重指数-1+/−，Eμ–myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−5-7周龄小鼠。B220细胞表面染色显示，由于Eμ–myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−小鼠和Eμ中前B细胞室的扩大myc公司但不在Eμ中myc；体重指数-1+/−老鼠。(D类)野生型Eμ–骨髓细胞悬液的流式细胞仪分析myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−小鼠，在不含特定生长因子的10%FBS/RPMI培养基中培养24小时，随后进行B220和Annexin-V染色+/附件蛋白-V−B220的+淋巴细胞表明骨髓源性前B细胞的凋亡敏感性。(E类)Annexin-V百分比分析+生存B220池中的细胞+/PI公司−淋巴细胞显示Eμ增加10倍myc；体重指数-1+/−小鼠与Eμ–myc公司老鼠。
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杂合性体重指数-1导致对淋巴腺病的敏感性降低，c-Myc诱导的前B细胞扩张消失，c-Myc诱导的凋亡增加。(A类)MoMLV诱导的Eμ–肿瘤的Kaplan-Meier生存曲线myc公司，Eμ–myc；bmi-1型+/−，体重指数-1+/−、野生型对照小鼠和(B类)Eμ中自发（前）B细胞淋巴瘤myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−老鼠。(C类)野生型骨髓细胞悬液的流式细胞仪分析，体重指数-1+/−，Eμ–myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−5-7周龄小鼠。B220细胞表面染色显示，由于Eμ–myc公司和Eμ–myc；体重指数-1+/−小鼠和Eμ中前B细胞室的扩大myc公司但不在Eμ中myc；体重指数-1+/−老鼠。(D类)野生型Eμ–骨髓细胞悬液的流式细胞仪分析myc公司，和Eμ–myc；体重指数-1+/−小鼠，在不含特定生长因子的10%FBS/RPMI培养基中培养24小时，随后进行B220和Annexin-V染色+/附件五−B220的+淋巴细胞表明骨髓源性前B细胞的凋亡敏感性。(E类)Annexin-V百分比分析+生存B220池中的细胞+/PI公司−淋巴细胞显示Eμ增加10倍myc；体重指数-1+/−小鼠与Eμ–myc公司老鼠。
图2
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Bmi-1与Myc协同抑制c-Myc诱导的细胞凋亡并强烈促进增殖ink4a–ARF-依赖方式。(A类)野生型MEF在第1代感染对照（C）或体重指数-1（B） 编码逆转录病毒，在第2代与任一对照，myc公司ER或myc公司HA编码逆转录病毒并通过台盼蓝排除法分析细胞活性。myc公司在存在（圆形）或不存在（方形）125 n的情况下，将ER过表达细胞群转移到0.1%血清后0、24和48小时，分析细胞死亡情况米4欧姆(左边).myc公司将HA过表达细胞转移到0.1%（圆形）或10%（方形）血清中后0、24和48小时，分析其细胞死亡情况(正确的). 在整个实验期间，控制感染的培养物存活率>95%（未显示）。亚倍体DNA含量细胞的流式细胞术分析证实了细胞凋亡。(B类)野生型或ink4a–ARF−/−MEF在第1代感染对照组（C，黑条）或体重指数-1（B，灰条）-编码逆转录病毒，随后在第2代与对照或myc公司ER逆转录病毒。感染后，将细胞转移到0.1%的血清中24小时后分析亚倍体DNA含量(左边)或在125n存在下转移至0.1%血清后0、16和26小时通过台盼蓝排除法检测细胞活力米4欧姆(正确的). （□+/-C；█ +/+B类；○ −/−C类；● −/−B.）(C类)野生型生长曲线(左边)或ink4a–ARF−/−MEF公司(正确的)在第1代感染对照（C）或体重指数-1（B） 编码逆转录病毒并在第2代进行控制或myc公司HA编码逆转录病毒。实验至少进行了三次，得到了高度重复的结果（所有标准偏差均在所示平均值的10%以内），并且通过使用myc公司ER逆转录病毒在没有4-OHT的情况下。（□控制C；不锈钢控制B；○ MycHA C；● MycHA B.）
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Bmi-1与Myc协同抑制c-Myc诱导的细胞凋亡并强烈促进增殖ink4a–ARF-依赖方式。(A类)野生型MEF在第1代感染对照（C）或体重指数-1（B） 编码逆转录病毒，在第2代与任一对照，myc公司ER或myc公司HA编码逆转录病毒并通过台盼蓝排除法分析细胞活性。myc公司在存在（圆形）或不存在（方形）125 n的情况下，将ER过表达细胞群转移到0.1%血清后0、24和48小时，分析细胞死亡情况米4欧姆(左边).myc公司将HA过表达细胞转移到0.1%（圆形）或10%（方形）血清中后0、24和48小时，分析其细胞死亡情况(正确的). 在整个实验期间，控制感染的培养物存活率>95%（未显示）。亚倍体DNA含量细胞的流式细胞术分析证实了细胞凋亡。(B类)野生型或ink4a–ARF−/−MEF在第1代感染对照组（C，黑条）或体重指数-1（B，灰色条）-编码逆转录病毒，随后在第2代与对照或myc公司ER逆转录病毒。感染后，将细胞转移到0.1%的血清中24小时后分析亚倍体DNA含量(左边)或在125n存在下转移至0.1%血清后0、16和26小时通过台盼蓝排除法检测细胞活力米4欧姆(正确的). （□+/+C；█ +/+B类；○ −/−C类；● −/−B.）(C类)野生型生长曲线(左边)或ink4a–ARF−/−MEF公司(正确的)在第1代感染对照（C）或体重指数-1（B） 编码逆转录病毒，并在第2代与对照或myc公司HA编码逆转录病毒。实验至少进行了三次，得到了高度重复的结果（所有标准偏差均在所示平均值的10%以内），并且通过使用myc公司ER逆转录病毒在没有4-OHT的情况下。（□控制C；█ 控制B；○ MycHA C；● MycHA B.）
图2
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Bmi-1与Myc协同抑制c-Myc诱导的细胞凋亡并强烈促进增殖ink4a–ARF-依赖方式。(A类)野生型MEF在第1代感染对照（C）或体重指数-1（B） 编码逆转录病毒，在第2代与任一对照，myc公司ER或myc公司HA编码逆转录病毒并通过台盼蓝排除法分析细胞活性。myc公司在存在（圆形）或不存在（方形）125 n的情况下，将ER过表达细胞群转移到0.1%血清后0、24和48小时，分析细胞死亡情况米4欧姆(左边).myc公司将HA过表达细胞转移到0.1%（圆形）或10%（方形）血清中后0、24和48小时，分析其细胞死亡情况(正确的). 在整个实验期间，控制感染的培养物存活率>95%（未显示）。亚倍体DNA含量细胞的流式细胞术分析证实了细胞凋亡。(B类)野生型或ink4a–ARF−/−MEF在第1代感染对照组（C，黑条）或bmi-1型（B，灰条）-编码逆转录病毒，随后在第2代与对照或myc公司ER逆转录病毒。感染后，将细胞转移到0.1%的血清中24小时后分析亚倍体DNA含量(左边)或在125n存在下转移至0.1%血清后0、16和26小时通过台盼蓝排除法检测细胞活力米4欧姆(正确的). （□+/+C；█ +/+B类；○ −/−C类；● −/−B.）(C类)野生型生长曲线(左边)或ink4a–ARF−/−MEF公司(正确的)在第1代感染对照（C）或体重指数-1（B） 编码逆转录病毒并在第2代进行控制或myc公司HA编码逆转录病毒。实验至少进行了三次，得到了高度重复的结果（所有标准偏差均在所示平均值的10%以内），并且通过使用myc公司ER逆转录病毒在没有4-OHT的情况下。（□控制C；█ 控制B；○ MycHA C；● MycHA B.）
图3
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(A类)Myc和Bmi-1诱导MEF转化。用软琼脂法检测第一代感染MEF的对照或体重指数-1-编码逆转录病毒并随后进行控制或myc公司-编码逆转录病毒。(B类)Bmi-1抑制Myc对p19arf的诱导。显示首先用对照感染的野生型MEFs中p16、p19arf、MycHA、MycER和Bmi-1蛋白水平的蛋白质印迹（C）或体重指数-1（B） 逆转录病毒和随后的对照，myc公司HA，或myc公司ER逆转录病毒。微管蛋白水平作为负荷控制。Bmi-1的过度表达导致p16和p19arf水平的下调，而MycHA或MycER的过度表达（在没有4-OHT的情况下）诱导p19arf而非p16。Bmi-1和Myc的联合过表达完全消除了Myc对p19arf的诱导作用。
图3
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(A类)Myc和Bmi-1诱导MEF转化。用软琼脂法检测第一代感染MEF的对照或体重指数-1-编码逆转录病毒并随后进行控制或myc公司-编码逆转录病毒。(B类)Bmi-1抑制Myc对p19arf的诱导。Western blot显示首先感染对照组（C）或体重指数-1（B） 逆转录病毒和随后的对照，myc公司HA，或myc公司ER逆转录病毒。微管蛋白水平作为负荷控制。Bmi-1的过度表达导致p16和p19arf水平的下调，而MycHA或MycER的过度表达（在没有4-OHT的情况下）诱导p19arf而非p16。Bmi-1和Myc的联合过表达完全消除了Myc对p19arf的诱导作用。
图4
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剂量效应ink4a–ARF+/−MEF公司。(A类)ink4a–ARF+/−在Myc过度表达方面，MEF的增殖速度快于野生型MEF。野生型生长曲线(+/+),ink4a–ARF+/−(正确的)、和墨迹4a–ARF−/−(左边)MEF感染myc公司ER病毒，存在（填充符号）或不存在（开放符号）250 n米4欧姆。GFP表达分析和Western分析证实野生型和ink4a–ARF+/−MEF公司。(B类)ink4a–ARF+/−MEF更容易通过myc公司和ras（拉斯维加斯）致癌基因。第一代野生型，ink4a–ARF+/−、和ink4a–ARF−/−MEF感染了对照组或ras（拉斯维加斯）第12版-编码逆转录病毒并随后感染对照或myc公司HA逆转录病毒，然后分析细胞在软琼脂中的生长情况。在软琼脂中培养2周后拍摄照片。使用myc公司ER病毒在没有4-OHT的情况下，除了菌落较小外。(C、 D类)ink4a–ARF+/−;ras/myc转化的菌落保留了野生型ink4a–ARF等位基因和野生型p53。(C类)野生型（WT）和突变型（KO）的PCR分析ink4a–ARF16个受试者中9个的等位基因ink4a–ARF+/−;ras/myc软琼脂集落，在电镀2周后从琼脂中取出，直接进行DNA分离和PCR。仅发现一例患者出现LOH。从野生型中分离出的DNA，ink4a–ARF+/−、和ink4a–ARF−/−MEF作为控制(D类)突变型p53蛋白的Western blot分析墨迹4a–ARF+/−;ras/myc软琼脂菌落，在平板后1.5周从琼脂中取出，在裂解前膨胀1.5周。根据标准3T3协议（通道1)含有突变型p53，但主要为野生型MEF（车道2)12个测试中有6个ink4a–ARF+/−;ras/myc菌落（车道3–8)没有。微管蛋白水平分析作为负荷控制。(E类)野生型和非野生型p19arf的诱导ink4a–ARF+/−MEF感染myc公司ER病毒，在有（+）或无（−）250 n的条件下培养米4欧姆。
图4
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剂量效应ink4a–ARF+/−MEF公司。(A类)ink4a–ARF+/−在Myc过度表达方面，MEF的增殖速度快于野生型MEF。野生型生长曲线(+/+),ink4a–ARF+/−(正确的)、和ink4a–ARF−/−(左边)MEF感染myc公司ER病毒，存在（填充符号）或不存在（开放符号）250 n米4欧姆。GFP表达分析和Western分析证实野生型和ink4a–ARF+/−MEF公司。(B类)ink4a–ARF+/−MEF更容易通过myc公司和ras（拉斯维加斯）致癌基因。第一代野生型，ink4a–ARF+/−、和ink4a–ARF−/−MEF感染对照或ras（拉斯维加斯）V12版本-编码逆转录病毒并随后感染对照或myc公司HA逆转录病毒，然后分析细胞在软琼脂中的生长情况。在软琼脂中培养2周后拍摄照片。使用myc公司ER病毒在没有4-OHT的情况下，除了菌落较小外。(C、 D类)ink4a–ARF+/−;ras/myc转化的菌落保留了野生型ink4a–ARF等位基因和野生型p53。(C类)野生型（WT）和突变型（KO）的PCR分析ink4a–ARF16个受试者中9个的等位基因ink4a–ARF+/−;ras/myc软琼脂集落，在电镀2周后从琼脂中取出，直接进行DNA分离和PCR。仅发现一例患者出现LOH。从野生型中分离出的DNA，ink4a–ARF+/−、和ink4a–ARF−/−MEF作为控制(D类)突变型p53蛋白的Western blot分析ink4a–ARF+/−;ras/myc软琼脂菌落，在平板后1.5周从琼脂中取出，在裂解前膨胀1.5周。根据标准3T3协议（通道1)含有突变型p53，但主要为野生型MEF（车道2)和12个测试中的6个ink4a–ARF+/−;ras/myc菌落（车道3–8)没有。微管蛋白水平分析作为负荷控制。(E类)p19arf在野生型和ink4a–ARF+/−MEF感染myc公司ER病毒，在有（+）或无（−）250 n的条件下培养米4欧姆。
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剂量效应ink4a–ARF+/−MEF公司。(A类)ink4a–ARF+/−在Myc过表达时，MEFs比野生型MEFs增殖更快。野生型生长曲线(+/+),ink4a–ARF+/−(正确的)、和ink4a–ARF−/−(左边)MEF感染myc公司ER病毒，存在（填充符号）或不存在（开放符号）250 n米4欧姆。GFP表达分析和Western分析证实野生型和ink4a–ARF+/−MEF公司。(B类)ink4a–ARF+/−MEF更容易通过myc公司和ras（拉斯维加斯）致癌基因。第一代野生型，ink4a–ARF+/−、和ink4a–ARF−/−MEF感染了对照组或ras（拉斯维加斯）V12版本-编码逆转录病毒并随后感染对照或myc公司HA逆转录病毒，然后分析细胞在软琼脂中的生长情况。在软琼脂中培养2周后拍摄照片。使用myc公司ER病毒在不存在4-OHT的情况下，除了菌落较小。(C、 D类)ink4a–ARF+/−;ras/myc转化的菌落保留了野生型墨迹4a–ARF等位基因和野生型p53。(C类)野生型（WT）和突变型（KO）的PCR分析ink4a–ARF16个受试者中9个的等位基因ink4a–ARF+/−;ras/myc软琼脂集落，在电镀2周后从琼脂中取出，直接进行DNA分离和PCR。仅发现一例患者出现LOH。从野生型中分离出的DNA，ink4a–ARF+/−、和ink4a–ARF−/−MEF作为控制(D类)突变型p53蛋白的Western blot分析ink4a–ARF+/−;ras/myc软琼脂菌落，在平板后1.5周从琼脂中取出，在裂解前膨胀1.5周。根据标准3T3协议（通道1)含有突变型p53，但主要为野生型MEF（车道2)和12个测试中的6个ink4a–ARF+/−;ras/myc菌落（车道3–8)没有。微管蛋白水平分析作为负荷控制。(E类)野生型和非野生型p19arf的诱导ink4a–ARF+/−MEF感染myc公司ER病毒，在有（+）或无（−）250 n的条件下培养米4欧姆。
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剂量效应ink4a–ARF+/−MEF公司。(A类)墨迹4a–ARF+/−在Myc过度表达方面，MEF的增殖速度快于野生型MEF。野生型生长曲线(+/+),ink4a–ARF+/−(正确的)、和ink4a–ARF−/−(左边)MEF感染myc公司ER病毒，存在（填充符号）或不存在（开放符号）250 n米4欧姆。GFP表达分析和Western分析证实野生型和ink4a–ARF+/−MEF公司。(B类)墨迹4a–ARF+/−MEF更容易通过myc公司和ras（拉斯维加斯）致癌基因。第一代野生型，ink4a–ARF+/−、和ink4a–ARF−/−MEF感染了对照组或ras（拉斯维加斯）V12版本-编码逆转录病毒并随后感染对照或myc公司HA逆转录病毒，然后分析细胞在软琼脂中的生长情况。在软琼脂中培养2周后拍摄照片。使用myc公司ER病毒在没有4-OHT的情况下，除了菌落较小外。(C、 D类)ink4a–ARF+/−;ras/myc转化的菌落保留了野生型ink4a–ARF等位基因和野生型p53。(C类)野生型（WT）和突变型（KO）的PCR分析ink4a–ARF16个受试者中9个的等位基因ink4a–ARF+/−;ras/myc软琼脂集落，在平板后2周从琼脂中取出并直接进行DNA分离和PCR。仅发现一例患者出现LOH。从野生型中分离出的DNA，ink4a–ARF+/−、和墨迹4a–ARF−/−MEF作为控制(D类)突变型p53蛋白的Western blot分析ink4a–ARF+/−;ras/myc软琼脂菌落，在平板后1.5周从琼脂中取出，在裂解前膨胀1.5周。根据标准3T3协议（通道1)含有突变型p53，但主要为野生型MEF（车道2)和12个测试中的6个ink4a–ARF+/−;ras/myc菌落（车道3–8)没有。微管蛋白水平分析作为负荷控制。(E类)野生型和非野生型p19arf的诱导ink4a–ARF+/−MEF感染myc公司ER病毒，在有（+）或无（−）250 n的条件下培养米4欧姆。
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剂量效应ink4a–ARF+/−MEF公司。(A类)ink4a–ARF+/−在Myc过度表达方面，MEF的增殖速度快于野生型MEF。野生型生长曲线(+/+),ink4a–ARF+/−(正确的)、和ink4a–ARF−/−(左边)感染了myc公司ER病毒，存在（填充符号）或不存在（开放符号）250 n米4欧姆。GFP表达分析和Western分析证实野生型和墨迹4a–ARF+/−MEF公司。(B类)ink4a–ARF+/−MEF更容易通过myc公司和ras（拉斯维加斯）致癌基因。第一代野生型，ink4a–ARF+/−、和ink4a–ARF−/−MEF感染了对照组或ras（拉斯维加斯）V12版本-编码逆转录病毒并随后感染对照或myc公司HA逆转录病毒，之后分析细胞在软琼脂中的生长。在软琼脂中培养2周后拍摄照片。使用myc公司ER病毒在没有4-OHT的情况下，除了菌落较小外。(C、 D类)ink4a–ARF+/−;ras/myc转化的菌落保留了野生型ink4a–ARF等位基因和野生型p53。(C类)野生型（WT）和突变型（KO）的PCR分析ink4a–ARF16个受试者中9个的等位基因ink4a–ARF+/−;ras/myc软琼脂集落，在电镀2周后从琼脂中取出，直接进行DNA分离和PCR。仅发现一例患者出现LOH。从野生型中分离出的DNA，ink4a–ARF+/−、和ink4a–ARF−/−MEF作为控制(D类)突变型p53蛋白的Western blot分析ink4a–ARF+/−;ras/myc软琼脂菌落，在平板后1.5周从琼脂中取出，在裂解前膨胀1.5周。根据标准3T3协议（泳道1)含有突变型p53，但主要为野生型MEF（车道2)和12个测试中的6个ink4a–ARF+/−;ras/myc集落（泳道3–8)没有。微管蛋白水平分析作为负荷控制。(E类)野生型和非野生型p19arf的诱导ink4a–ARF+/−MEF感染myc公司ER病毒，在有（+）或无（−）250 n的条件下培养米4欧姆。
图5
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Eμ-淋巴腺病严重加速myc；ink4a–ARF+/−老鼠。(A类)Eμ–myc；ink4a–ARF+/−小鼠很快死于侵袭性B细胞肿瘤。Eμ–的Kaplan-Meier生存图myc；ink4a–ARF+/−小鼠和Eμ-myc公司老鼠。(B类)出现在Eμ–myc；ink4a–ARF+/−和Eμ–myc公司老鼠和这些动物的血液ink4a–ARF−/−老鼠。(A类)Eμ的典型示例myc；墨迹4a–ARF+/−肿瘤侵犯肝脏；(B类)肺血管Eμ-myc；墨迹4a–ARF+/−充满肿瘤细胞的小鼠。(C类)Eμ肺血管的典型示例myc公司小鼠，无肿瘤细胞；(D-F公司)Eμ–的血液myc；ink4a–ARF+/−(D类)，Eμ–myc公司(E类)、和ink4a–ARF−/−(F类)老鼠。注意，与Eμ相比myc公司和墨迹4a–ARF−/−小鼠，Eμ-的血液myc；ink4a–ARF+/−小鼠有高度白血病。(G、 H（H）)Eμ中出现的典型肿瘤的高倍放大myc；ink4a–ARF+/−(G公司)和Eμ–myc公司(H（H）)老鼠。注意Eμ中存在更多的固缩肿瘤细胞，这表明细胞凋亡myc公司与Eμ相比，肿瘤myc；ink4a–ARF+/−肿瘤。照片是10倍拍摄的(A-C公司)和20倍(D-H公司)放大倍数。(C类)三种Eμ–的细胞悬浮液的流动滴定分析myc；ink4a–ARF+/−细胞表面CD8、CD4、sIgM和B220染色后的肿瘤。(D类)Southern blot分析ink4a–ARF从正常肝脏（L）或肿瘤（T）组织分离的基因组DNA的状态，显示ink4a–ARF肿瘤发生部位Eμ-myc；墨迹4a–ARF+/−（车道1)和CD2–myc；ink4a–ARF+/−（车道三)小鼠，但不在CD2中–myc公司（车道2)Eμ–myc公司（车道5)和Eμ–bmi-1；ink4a–ARF+/−（车道4)老鼠。
图5
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Eμ-淋巴腺病严重加速myc；ink4a–ARF+/−老鼠。(A类)Eμ–myc；ink4a–ARF+/−小鼠很快死于侵袭性B细胞肿瘤。Eμ–的Kaplan-Meier生存图myc；ink4a–ARF+/−小鼠和Eμ-myc公司老鼠。(B类)出现在Eμ–myc；ink4a–ARF+/−和Eμ–myc公司老鼠和这些动物的血液ink4a–ARF−/−老鼠。(A类)Eμ–的代表性示例myc；ink4a–ARF+/−肿瘤侵犯肝脏；(B类)肺血管Eμ-myc；ink4a–ARF+/−充满肿瘤细胞的小鼠。(C类)肺血管Eμ的典型示例myc公司小鼠，无肿瘤细胞；(D-F公司)Eμ–的血液myc；ink4a–ARF+/−(D类)，Eμ–myc公司(E类)、和ink4a–ARF−/−(F类)老鼠。注意，与Eμ相比myc公司和ink4a–ARF−/−小鼠，Eμ-的血液myc；ink4a–ARF+/−小鼠有高度白血病。(G、 H（H）)Eμ中出现的典型肿瘤的高倍放大myc；ink4a–ARF+/−(G公司)和Eμ–myc公司(H（H）)老鼠。注意Eμ中存在更多的固缩肿瘤细胞，这表明细胞凋亡myc公司与Eμ相比，肿瘤myc；ink4a–ARF+/−肿瘤。照片是10倍拍摄的(A-C公司)和20倍(D-H公司)放大倍数。(C类)三种Eμ–的细胞悬浮液的流式细胞仪分析myc；ink4a–ARF+/−细胞表面CD8、CD4、sIgM和B220染色后的肿瘤。(D类)Southern印迹分析ink4a–ARF从正常肝脏（L）或肿瘤（T）组织中分离出的基因组DNA的状态，显示ink4a–ARF肿瘤发生部位Eμ-myc；ink4a–ARF+/−（车道1)和CD2–myc；ink4a–ARF+/−（车道三)小鼠，但不在CD2中–myc公司（车道2)Eμ–myc公司（车道5)和Eμ–体重指数-1；ink4a–ARF+/−（车道4)老鼠。
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Eμ-淋巴腺病严重加速myc；ink4a–ARF+/−老鼠。(A类)Eμ–myc；ink4a–ARF+/−小鼠很快死于侵袭性B细胞肿瘤。Eμ–的Kaplan-Meier生存图myc；ink4a–ARF+/−小鼠和Eμ-myc公司老鼠。(B类)出现在Eμ–myc；ink4a–ARF+/−和Eμ–myc公司老鼠和这些动物的血液ink4a–ARF−/−老鼠。(A类)Eμ的典型示例myc；ink4a–ARF+/−肿瘤侵犯肝脏；(B类)肺血管Eμ-myc；ink4a–ARF+/−充满肿瘤细胞的小鼠。(C类)肺血管Eμ的典型示例myc公司小鼠，无肿瘤细胞；(D-F公司)Eμ–的血液myc；ink4a–ARF+/−(D类)，Eμ–myc公司(E类)、和ink4a–ARF−/−(F类)老鼠。注意，与Eμ相比myc公司和ink4a–ARF−/−小鼠，Eμ-的血液myc；ink4a–ARF+/−小鼠有高度白血病。(G、 H（H）)Eμ中出现的典型肿瘤的高倍放大myc；ink4a–ARF+/−(G公司)和Eμ–myc公司(H（H）)老鼠。注意Eμ中存在更多的固缩肿瘤细胞，这表明细胞凋亡myc公司肿瘤与Eμ相比myc；ink4a–ARF+/−肿瘤。照片是10倍拍摄的(A-C公司)和20倍(D-H公司)放大倍数。(C类)三种Eμ–的细胞悬浮液的流动滴定分析myc；ink4a–ARF+/−细胞表面CD8、CD4、sIgM和B220染色后的肿瘤。(D类)Southern blot分析ink4a–ARF从正常肝脏（L）或肿瘤（T）组织中分离出的基因组DNA的状态，显示ink4a–ARF肿瘤发生部位Eμ-myc；ink4a–ARF+/−（车道1)和CD2–myc；ink4a–ARF+/−（车道三)小鼠，但不在CD2中–myc公司（车道2)Eμ–myc公司（车道5)和Eμ–体重指数-1；ink4a–ARF+/−（车道4)老鼠。
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Eμ-淋巴腺病严重加速myc；墨迹4a–ARF+/−老鼠。(A类)Eμ–myc；ink4a–ARF+/−小鼠很快死于侵袭性B细胞肿瘤。Eμ–的Kaplan-Meier生存图myc；ink4a–ARF+/−小鼠和Eμ-myc公司老鼠。(B类)出现在Eμ–myc；ink4a–ARF+/−和Eμ–myc公司老鼠和这些动物的血液ink4a–ARF−/−老鼠。(A类)Eμ的典型示例myc；ink4a–ARF+/−肿瘤侵犯肝脏；(B类)肺血管Eμ-myc；ink4a–ARF+/−充满肿瘤细胞的小鼠。(C类)肺血管Eμ的典型示例myc公司小鼠，无肿瘤细胞；(D-F公司)Eμ–的血液myc；ink4a–ARF+/−(D类)，Eμ–myc公司(E类)、和ink4a–ARF−/−(F类)老鼠。注意，与Eμ相比myc公司和ink4a–ARF−/−小鼠，Eμ-的血液myc；ink4a–ARF+/−小鼠患有高度白血病。(G、 H（H）)Eμ中出现的典型肿瘤的高倍放大myc；ink4a–ARF+/−(G公司)和Eμ–myc公司(H（H）)老鼠。注意Eμ中存在更多的固缩肿瘤细胞，这表明细胞凋亡myc公司与Eμ相比，肿瘤myc；ink4a–ARF+/−肿瘤。照片是10倍拍摄的(A-C公司)和20倍(D-H公司)放大倍数。(C类)三种Eμ–的细胞悬浮液的流动滴定分析myc；ink4a–ARF+/−细胞表面CD8、CD4、sIgM和B220染色后的肿瘤。(D类)Southern blot分析ink4a–ARF从正常肝脏（L）或肿瘤（T）组织中分离出的基因组DNA的状态，显示ink4a–ARF肿瘤发生部位Eμ-myc；ink4a–ARF+/−（车道1)和CD2–myc；ink4a–ARF+/−（车道三)小鼠，但不在CD2中–myc公司（车道2)Eμ–myc公司（车道5)和Eμ–体重指数-1；ink4a–ARF+/−（车道4)老鼠。
图6
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胸腺细胞凋亡增加体重指数-1−/−删除ink4a–ARF.～6周龄新鲜分离胸腺细胞的流式细胞仪分析ink4a–ARF+/−，体重指数-1−/−;ink4a–ARF+/−、和体重指数-1−/−;ink4a–ARF−/−细胞表面CD4和CD8染色后的小鼠(左边)Annexin-V染色后CD4阳性胸腺细胞(正确的).
图7
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Bcl2过度表达部分拯救了体重指数-1−/−脾脏（黑色条）和胸腺（灰色条）。(A类)～6周龄野生型SV胸腺和脾脏中有核细胞的百分比bcl2、bmi-1−/−、SVbcl2；体重指数-1−/−老鼠(左边)野生型，Eμ–β细胞淋巴瘤/白血病基因2，体重指数-1−/−，Eμ–bcl2；体重指数-1−/−老鼠(正确的). (B类)野生型SV胸腺细胞和脾细胞的流式细胞仪分析β细胞淋巴瘤/白血病基因2，体重指数-1−/−和SVbcl2；体重指数-1−/−老鼠。
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Bcl2过度表达部分拯救了体重指数-1−/−脾脏（黑色条）和胸腺（灰色条）。(A类)～6周龄野生型SV胸腺和脾脏中有核细胞的百分比bcl2、bmi-1−/−、SVbcl2；体重指数-1−/−老鼠(左边)野生型，Eμ–β细胞淋巴瘤/白血病基因2，体重指数-1−/−，Eμ–bcl2；体重指数-1−/−老鼠(正确的). (B类)野生型SV胸腺细胞和脾细胞的流式细胞仪分析β细胞淋巴瘤/白血病基因2，体重指数-1−/−、和SVbcl2；体重指数-1−/−老鼠。
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