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.1999年7月20日；96(15):8745-50.
doi:10.1073/pnas.96.15.8745。

锂激活丝氨酸/苏氨酸激酶Akt-1并抑制谷氨酸诱导的神经元Akt-1活性抑制

E Chalecka-Franaszek公司 1, D M Chuang先生
附属公司

锂激活丝氨酸/苏氨酸激酶Akt-1并抑制谷氨酸诱导的神经元Akt-1活性抑制

E Chalecka-Franaszek公司等。 美国国家科学院程序. .

摘要

本报告描述了锂和谷氨酸对丝氨酸/苏氨酸激酶Akt-1活性的调节作用。锂最常用于治疗双相情感障碍，但其治疗作用机制尚不清楚。我们最近证明，锂可以保护培养的脑神经元和脑缺血动物模型免受谷氨酸诱导的兴奋性毒性。本研究旨在探讨由磷脂酰肌醇3-激酶（PI 3-K）信号通路激活的Akt-1在介导小脑颗粒细胞谷氨酸兴奋毒性和锂保护中的作用。在有血清培养的小脑神经元中检测到高水平的磷酸化和Akt-1活性。长期使用选择性PI 3-K抑制剂沃特曼（wortmannin）和LY294002治疗，可消除Akt-1活性，并诱导神经元死亡，而长期锂预处理可减少这种死亡。细胞暴露于谷氨酸后，Akt-1磷酸化和激酶活性迅速可逆地丧失。这些作用与兴奋性毒性和胱天蛋白酶3激活密切相关，并被磷酸酶抑制剂、冈田酸和杯状蛋白A阻止。长期锂预处理抑制了谷氨酸诱导的Akt-1活性的丧失，并加速其恢复到对照水平。单独的锂处理诱导了PI3-K活性的快速增加，以及伴随激酶激活的Akt-1磷酸化，这被PI3-K抑制剂阻断。锂还增加了Akt下游生理靶点糖原合成酶激酶-3（GSK-3）的磷酸化。因此，Akt-1活性的调节似乎在谷氨酸兴奋性毒性和锂神经保护机制中起着关键作用。

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数字

图1
图1
PI 3-K活性对CGC的存活和维持基础Akt-1磷酸化和激酶活性至关重要。(一和b条)未经或经锂预处理的PI 3-K抑制剂对神经元存活的影响：在第1天用3 mM LiCl处理CGC体外然后暴露于指定浓度的麦芽甘露(一)或LY294002（LY）(b条)第4天体外。由于该抑制剂在水中不稳定，因此每12小时重复服用一次沃特曼。在第8天通过MTT分析测定细胞活力体外. (c（c）和d日)锂对PI 3-K活性的影响：用3 mM LiCl处理细胞5或30 min。用PI作为底物测定免疫沉淀PI 3-K的活性。通过放射自显影术观察放射性PI 3-P产物(c（c）)并量化(d日)。实验重复了三次，结果相似。(e（电子）)血清Akt-1磷酸化的免疫印迹473在用各种激酶抑制剂处理的CGC中：用100 nM麦芽汁、50μM LY、10μM SB 230580（SB）或10μM PD 98059（PD）处理细胞30分钟。用磷酸特异性Akt-1抗体进行免疫印迹3次，结果相似。(（f）)用各种激酶抑制剂处理的CGC的免疫复合物Akt-1激酶检测：用100 nM麦芽汁、50μM LY、10μM SB或10μM PD处理细胞30 min，并检测细胞裂解物的Akt-1酶活性。(克)血清剥夺对免疫复合物Akt-1活性的影响：CGC在含有10%FCS的培养基中培养8天。然后在收获前的指定时间（1.5或24小时）将培养基切换为无血清培养基。结果显示于a、 b、f、，和克是三到六个独立实验中的平均值±SEM。
图2
图2
谷氨酸迅速抑制Akt-1磷酸化和激酶活性，伴随着细胞活力的丧失和PARP分裂的诱导。长期锂处理可抑制这些影响。(一)谷氨酸对Akt-1活性和细胞活力的浓度依赖性影响：用指示浓度的谷氨酸处理CGC 30分钟。从细胞裂解物中免疫沉淀Akt-1，并测量激酶活性。姐妹培养物用相同浓度的谷氨酸处理20小时，并用MTT法检测细胞活力。(b条和c（c）)谷氨酸诱导Akt-1磷酸化和总Akt蛋白抑制的时间过程(b条)或使用(c（c）)3 mM LiCl持续7天，然后用50μM谷氨酸处理以进行磷酸特异性免疫印迹（Ser473)阿克特-1(上部blots）和Akt抗体识别Akt-1，与其磷酸化状态无关(下部斑点）。(d日)在不存在或存在锂的情况下，用谷氨酸处理的CGCs中的Akt-1激酶活性；中所述实验中使用的一些样品的等分试样（500μg蛋白质）b条和c（c）使用。从不使用或使用3 mM LiCl预处理7天的细胞中免疫沉淀Akt-1，然后暴露于50μM谷氨酸达指定时间，并采集用于Akt-1激酶活性测定。(e（电子）)在无锂或有锂的情况下谷氨酸诱导的细胞丢失的时间过程：CGC在不含或含3 mM LiCl的情况下预处理7天，然后暴露于50μM谷氨酸中，时间为MTT法测定细胞活力之前指示的时间。(（f）)通过锂预处理防止谷氨酸诱导的caspase 3激活：用3 mM LiCl处理细胞7天和/或50μM谷氨酸，并用PARP特异性抗体进行免疫印迹。来自至少三个实验的代表性免疫印迹显示于b条，c、，和（f）结果如所示一，日期：，和e（电子）是三个独立实验的平均值±SEM。
图3
图3
锂以时间和浓度依赖的方式增加Akt激酶活性和磷酸化。(一)锂对Akt-1活性的影响：用3 mM LiCl处理细胞指定的时间，并通过免疫复合物激酶分析测定细胞裂解液中的Akt-1激酶活性。(插入)在LiCl处理后的指定时间，使用对Akt-1、Akt-2和Akt-3亚型具有选择性的抗体进行相同的激酶活性测定。(b条)锂对Akt-1（Ser）的影响473)磷酸化和Akt总蛋白水平：为实验准备的样本等分一用磷酸特异性（Ser）进行免疫印迹473)Akt-1抗体(上部)和Akt抗体(下部)。(c（c）)急性锂诱导Akt-1（Ser）的浓度依赖性473)磷酸化和Akt-1激酶活性：用LiCl处理细胞30分钟，然后收获细胞进行磷酸特异性（Ser473)Akt-1抗体(顶部)，用于Akt-1激酶活性测量(中部)和用磷酸化依赖性Akt抗体进行免疫印迹(底部)。(d日)长时间锂诱导的Akt-1（Ser）浓度依赖性473)磷酸化和总Akt蛋白水平：用氯化锂处理细胞7天，然后用磷酸特异性（Ser473)Akt-1（上印迹）和Akt抗体（下印迹）。Akt活动导致一和c（c）是至少四个独立实验的平均值±SEM。重复三次实验的代表性免疫印迹如所示b条，c、，和d。
图4
图4
谷氨酸减少和锂增加Akt-1活性的药理和生化特征。(一)NMDA受体拮抗剂MK-801阻止了谷氨酸诱导的Akt-1活性抑制，而半胱天冬酶3抑制剂氟甲基酮肽类似物Z-DEVD-fmk则没有。第8天的细胞体外用10μM MK-801或200μM Z-DEVD-fmk处理40分钟，然后用50μM谷氨酸处理30分钟，以进行Akt-1激酶活性测定。(b条)蛋白磷酸酶抑制剂对谷氨酸抑制的Akt-1活性的影响：细胞在暴露于50μM谷氨酸15分钟之前，用指示浓度的冈田酸或caliculin A预处理60分钟，并检测Akt-1激酶活性。(c（c）)锂诱导Akt-1活化的特征：第8天的细胞体外用3mM LiCl处理20分钟，无需或用100nM wortmannin或10μM LY294002预处理30分钟。当需要时，还用200μM L-690330（一种肌醇单磷酸酶抑制剂）或2μM胰岛素处理细胞20分钟，并测定Akt-1活性。(d日)锂对GSK-3α（Ser21)磷酸化和总GSK-3:CGC用3 mM LiCl处理指定时间，并用磷酸特异性（Ser21)抗GSK-3α抗体（上印迹）和总GSK-3抗体（下印迹）。显示了两个实验的代表性免疫印迹。量化结果一，b、，和c（c）是至少四个独立实验的平均值±SEM。
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