Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation

doi:10.1073/pnas.96.13.7376

.1999年6月22日；96(13):7376-81.

doi:10.1073/pnas.96.13.7376。

mRad50的破坏会导致胚胎干细胞死亡、胚胎发育异常以及对电离辐射的敏感性

G罗¹, M S姚明, C F折弯机, M磨机, A R布拉德, 布拉德利, J H彼得里尼

附属公司

PMID： 10377422
预防性维修识别码： PMC22093型
内政部： 10.1073/pnas.96.13.7376

mRad50的破坏会导致胚胎干细胞死亡、胚胎发育异常以及对电离辐射的敏感性

G罗等。美国国家科学院程序. 1999.

.1999年6月22日；96(13):7376-81.

doi:10.1073/pnas.96.13.7376。

作者

G罗¹, M S姚明, C F折弯机, M磨机, A R布拉德, A布拉德利, J H彼得里尼

附属

¹美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子与人类遗传学系，邮编77030。

PMID： 10377422
预防性维修识别码： PMC22093型
内政部： 10.1073/pnas.96.13.7376

摘要

Mre11/Rad50蛋白复合物在细胞对双链断裂（DSB）反应的不同方面发挥作用，包括检测DNA损伤、激活细胞周期检查点和DSB修复。虽然酿酒酵母的遗传分析提供了关于这种高度保守复合物的DSB修复功能的见解，但奈梅亨断裂综合征中人类复合物的含义揭示了其在细胞周期检查点功能中的作用。我们建立了mRad50突变小鼠，以检测哺乳动物Mre11/Rad50蛋白复合物在DNA损伤反应中的作用。mRad50缺陷的早期胚胎细胞对电离辐射过敏，这与该复合物在电离辐射诱导的DSB修复中的作用一致。然而，无效的mrad50突变在培养的胚胎干细胞和早期发育的胚胎中是致命的，这表明哺乳动物的Mre11/Rad50蛋白复合物介导正常生长细胞中对生存能力至关重要的功能。

PubMed免责声明

数字

图1
基因靶向*50米半径*轨迹。(一)的结构*50米半径*位点和靶向载体*pTV1电视*和*pTV2型*Southern blot杂交分析策略对两种靶向载体产生的靶向事件的识别是相同的。(b)首先通过使用5′外部探针（5P）识别目标克隆，该探针检测15-kb野生型的变化*Nco公司*I片段为一个新颖的7.8 kbNco公司I片段，然后用3′外部探针（3P）确认，该探针检测17-kb野生型的变化生态RV碎片变成新的14-kb生态RV碎片。目标等位基因由*pTV1电视*是一个无效等位基因（指定*50英里*^{Brdm1号机组}或*平方米*). 靶向等位基因使用*pTV2电视*作为载体是有条件的空等位基因(*mrad50型*^{英国广播公司1}或*c1级*). Cre重组酶介导的*PGK-neo公司*/*HSVtk公司*盒加上外显子1和250米半径等位基因导致无效等位基因（*50英里*^第2层或*平方米*等位基因），改变7.8-kb50英里^{英国广播公司1}等位基因*Nco公司*I片段为13-kbNco公司我的碎片。箭头所示的引物可用于PCR鉴定野生型（5Rad50t1+3Rad50t1）和*50英里*^{Brdm1号机组}等位基因（mRad50t1+3Rad50t1）。(*c（c）*)从中标识目标克隆*pTV2电视*目标载体。目标事件由箭头指示。15 kbNco公司野生型的I片段(重量)等位基因和主要靶基因7.8kb片段(*c1级*)显示了等位基因。(d日)拆卸*PGK-neo公司*/*HSVtk公司*盒加外显子1和250米半径来自*c1级*通过Cre等位基因产生*平方米*等位基因。亲代细胞系由箭头指示。13-kbNco公司I片段*平方米*还显示了等位基因。(电子)基因靶向*mRad50毫米*/*50英里*^第2层ES细胞*pTV1。*两个克隆，其中*平方米*突变等位基因被重新定位以产生一个空等位基因，*50英里*^{Brdm1号机组}(*平方米*)，（箭头）。(*（f）*)基因靶向*pTV1电视*在三体11号染色体突变的ES细胞中，含有重量等位基因和*平方米*等位基因。突变等位基因的重定位用箭头表示，而靶向是两个中的一个重量等位基因用开放箭头表示。

图2
在有*pm半径50*表达质粒。(一)的Southern印迹*Nco公司*我消化的DNA来自*平方米*/*c1级*C介导的重组事件删除外显子1和2之前和之后的细胞*pm半径50*.外部探针5P杂交到13-kb平方米-特定片段和7.8-kbc1级-特定片段。(b)*50米半径*cDNA补体的表达*平方米*/*平方米*细胞系。野生型分馏提取物（1-3车道）或*平方米*/*平方米*以补充*pm半径50*（通道4）细胞，用mRad50 mAb进行免疫印迹。野生型全细胞提取物（车道1）；用免疫前血清（泳道2）或mMre11抗血清（泳道3）免疫沉淀的野生型细胞提取物；和*平方米*/*平方米*/*pm半径50*用mMre11抗血清免疫沉淀的细胞提取物（第4道）。

图3
开发*50英里*突变胚胎。(*a–f*)野生型胚胎矢状切面苏木精/伊红染色(*a、 c、，*和电子)和突变胚胎(*b、日期：，*和*（f）*)在E6.0(一和b)，E6.5(*c（c）*和d日)和E7.5(电子和*（f）*). 注意突变胚胎的较小尺寸。到E6.5时，纯合突变胚胎发育到E6.0阶段之后还没有明显的发育。在许多情况下，突变胚胎正在被吸收。通过E7.5，纯合突变胚胎被完全吸收。（巴=100μm）(克–j个)野生型增殖细胞的BrdUrd标记(克和我)和突变型(小时和j个)胚胎分别为E6.0和E6.5。

图4
体外囊胚培养。(一和*c（c）*)6天后无需放射治疗即可进行囊胚移植。在野生型中，内细胞团（ICM）和滋养层巨细胞（TGC）的增殖都很显著(一)和突变型(*c（c）*)胚胎。(b和d日)2 Gyγ射线照射后6天进行囊胚移植。注意野生型胚胎内细胞团和滋养层细胞的活跃增殖(b). 相反，在突变胚胎中，内部细胞团被完全消融(d日). (电子)实验结束时胚泡外植体的典型PCR基因分型。

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