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.1999年7月；19(7):4643-52.
doi:10.1128/MCB19.7.4643。

对白介素-1（IL-1）无反应的突变细胞揭示了IL-1受体相关激酶的新作用

X李 1, M逗号, C烧伤, K维塔拉尼, Z曹, G R斯塔克
附属机构

对白介素-1（IL-1）无反应的突变细胞揭示了IL-1受体相关激酶的新作用

X李等。 分子细胞生物学. 1999年7月.

摘要

含有白细胞介素-1（IL-1）调节的疱疹胸苷激酶基因的突变人类293细胞，选自IL-1和更昔洛韦，已经产生了许多对IL-1无反应的独立克隆。这里分析的四个克隆携带隐性突变，代表三个互补组。补体组I1的突变体A缺乏IL-1受体相关激酶（IRAK），而其他两组的突变体在IRAK上游的未知成分中存在缺陷。外源性IRAK在I1A细胞（I1A-IRAK）中的表达可恢复其对IL-1的反应性。在IL-1处理的I1A细胞中，NFkappaB和Jun激酶均未激活，但这些反应在I1A-IRAK细胞中恢复，表明两者都需要IRAK。为了阐明IRAK激酶活性在IL-1信号传导中的作用，其ATP结合位点发生突变（K239A），完全消除激酶活性。在转染的I1A细胞中，IRAK-K239A在IL-1刺激下仍被磷酸化，令人惊讶的是，它仍然补充了突变细胞中的所有缺陷。因此，IRAK必须由另一种激酶磷酸化，磷酸化IRAK在不需要其激酶活性的IL-1介导的信号传导中发挥作用。

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数字

图1
图1
IL-1信号通路模型。详见正文。PC，磷脂酰胆碱。
图2
图2
在E-selectin启动子的控制下，使用TK和Zeo进行双重药物选择。（A） E-selectin–TK和E-selectin-Zeo。在TK cDNA或Zeo基因前克隆了E-selectin基因上游片段（−730至+52），该片段包含一个ATF和三个NF-κB结合位点以及一个TATA盒。（B） 药物选择。将E-selectin–TK和E-selectin-Zeo共转染到293细胞中，并在Zeo和IL-1中选择转染的细胞。检测单个克隆在更昔洛韦（GCV）中的存活率、更昔洛病毒加IL-1中的死亡、Zeo中的死亡以及Zeo加IL-1的存活率。其中一个克隆被扩增并进行了五轮突变。通过选择更昔洛韦和IL-1中的突变池，分离出IL-1无反应突变体。然后对假定的突变体进行了gancyclovir和gancylovir加IL-1存活率测试，以及Zeo和Zeo加IL-1死亡率测试。
图3
图3
IL-1无反应突变体分析。（A） NF-κB凝胶转移试验。从293-TK/Zeo细胞（野生型）和IL-1无反应突变体中提取细胞提取物，用IL-1（100 U/ml）或TNF-α（20 ng/ml）处理15分钟或不处理。以IP-10基因的NF-κB结合位点为探针。凝胶位移测定中的两条带主要是由p50-p65异二聚体（底部）和p65-p65同源二聚体（顶部）引起的（63a）。（B） 荧光素酶报告分析。将E-selectin–Luc（1μg/10-cm直径平板）瞬时转染到293-TK/Zeo细胞（WT）和IL-1无反应突变体中。36小时后，细胞要么未经处理，要么用IL-1（100 U/ml；封闭条）或TNF-α（20 ng/ml；孵化条）刺激4小时以上。将萤光素酶活性标准化为β-半乳糖苷酶。数据显示为处理细胞中荧光素酶活性的折叠诱导。显示了三个独立实验的平均值和标准偏差。（C） IL-8基因表达的Northern分析。293-TK/Zeo细胞（WT）和IL-1无反应突变体经IL-1（100 U/ml）或TNF-α（20 ng/ml）处理6小时或未经处理后获得总RNA。以人IL-8 cDNA为探针，用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）cDNA重新编码后对信号进行标准化。
图4
图4
NF-κB凝胶位移法检测显性和互补性。提取自293-TK/Zeo细胞（WT[野生型]）、克隆I1A和I2A以及异核体WT/I1A和I1A/I2A，用IL-1（100 U/ml）或TNF-α（20 ng/ml）处理15分钟或未处理。以IP-10基因的NF-κB结合位点为探针。
图5
图5
克隆I1A缺少IRAK。（A） IRAK蛋白分析。提取自293-TK/Zeo（WT[野生型]）细胞和IL-1无反应突变体。在西方国家转移后，用抗IRAK对等分样本进行分析。用抗IL-1R1探针检测相同的印迹。（B） IRAK和IRAK2 mRNA的分析。以IRAK或IRAK2 cDNA为探针，采用Northern方法分析293-TK/Zeo细胞（WT）和突变型I1A的总RNA。
图6
图6
补充IRAK或IRAK-K239A的I1A细胞分析。（A） 用E-selectin–Luc瞬时共转染细胞，并增加TK启动子驱动的IRAK表达载体或TK启动因子驱动的IRAK-K239A表达载体的数量。36小时后，细胞要么未经处理，要么在收获前用IL-1（100 U/ml）刺激4小时以上。荧光素酶活性归一化为β-半乳糖苷酶。数据显示为处理细胞中荧光素酶活性的折叠诱导。实验重复了四次。所示为典型实验的数据。（B） 用抗IRAK蛋白对瞬时转染IRAK或IRAK-K239A量增加的I1A细胞提取物进行Western分析。（C） 用IRAK或IRAK K239A稳定转染的293-TK/Zeo（野生型）、I1A或I1A细胞提取物的蛋白质分析。
图7
图7
IL-1诱导突变细胞中Jun激酶的激活。用抗Jun激酶从细胞提取物中制备免疫沉淀，然后进行体外激酶分析。（A） 分析293-TK/Zeo（WT[野生型]）细胞和I1A细胞的提取物，这些细胞未经转染或稳定转染IRAK或IRAK-K239A，未经处理，用IL-1刺激，或用UV（40 J/m）处理2). （B） 分析未经处理、用IL-1刺激或用紫外线（40 J/m）处理的克隆I1A、I2A和I3A的提取物2).
图8
图8
通过MyD88或TRAF6在I1A细胞中对信号的构成刺激。293-TK/Zeo（WT[野生型]）细胞和稳定转染IRAK或IRAK-K239A的I1A细胞与E-selectin–Luc、载体对照或MyD88或TRAF6表达载体瞬时共转染。荧光素酶活性归一化为β-半乳糖苷酶。数据显示为转染MyD88（固体棒）或TRAF6的细胞中荧光素酶的折叠诱导。显示了三个独立实验的平均值和标准偏差。
图9
图9
IRAK激酶分析。从稳定转染IRAK或IRAK-K239A的293-TK/Zeo（WT[野生型]）、I1A和I1A中提取细胞提取物。用抗IRAK抗体制备免疫沉淀，然后进行体外激酶分析。展示了短期和长期风险敞口。免疫沉淀样品也用抗IRAK（底部面板）进行分析。
图10
图10
IL-1刺激后IRAK随时间变化的西方分析。所示为野生型293TK/Zeo（WT）细胞和I3A细胞（A）、转染IRAK或IRAK-K239A（B）的I1A细胞以及未经处理或经IL-1处理的I1A/I3A异核体（C）的结果。用抗IRAK的Western程序分析细胞提取物。磷酸化IRAK；U-IRAK，泛素化IRAK。面板A和B的顶部为短曝光，底部为长曝光。用抗IL-1R1检测相同的转移，以控制负荷。（D和E）用IRAK或IRAK-K239A转染的I1A细胞的提取物，在有或没有IL-1刺激的情况下，未经处理或用小牛肠道磷酸酶（CIP）处理。
图11
图11
I1A细胞与IRAK2互补。E-selectin–Luc与对照载体MyD88或TRAF6瞬时共转染到稳定转染CMV-IRAK2（I1A-IRAK2细胞）的I1A细胞中。转染E-selectin–Luc的I1A-IRAK2细胞和对照载体用IL-1处理（100 U/ml，4 h）。数据显示，与对照载体转染的细胞相比，转染MyD88或TRAF6的IL-1处理或未处理细胞中荧光素酶活性的诱导倍数。显示了三个独立实验的平均值和标准偏差。
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