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。1999年5月；10(5):1353-66.
doi:10.1091/mbc.10.5.1353。

毕赤酵母过氧化物酶体的葡萄糖诱导自噬需要一种独特的E1样蛋白

W元 1, P E Stromhaug公司, 小W A Dunn
附属公司
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葡萄糖诱导的毕赤酵母过氧化物酶体自噬需要一种独特的E1样蛋白

W元等。 分子生物学细胞。 1999年5月。
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摘要

当毕赤酵母在甲醇中生长时，合成了甲醇同化所必需的细胞质酶和过氧化物酶体酶。在甲醇适应葡萄糖环境后，这些酶在酵母液泡中迅速选择性地被隔离和降解。当液泡改变形状并包围过氧化物酶体时，断流开始。相反的膜然后融合，吞噬过氧化物酶体。在本研究中，我们鉴定了葡萄糖诱导的过氧化物酶体选择性自噬缺陷的突变细胞系gsa7，并鉴定了gsa7基因。在葡萄糖适应后，gsa7细胞不能降解过氧异丙醇氧化酶。我们观察到过氧化物酶体被液泡包围，但没有完全吸收到液泡中。因此，我们认为GSA7不是启动自噬所必需的，而是将相反的液泡膜聚集在一起进行同型融合所必需的。通过对补充gsa7表型的基因组DNA片段进行测序，我们发现gsa7编码71 kDa（Gsa7p）的蛋白质，与泛素激活酶E1家族的序列同源性有限。敲除突变体gsa7Delta与gsa7具有相同的表型，两个突变体均由表位标记的Gsa7p（gsa7-血凝素[HA]）拯救。此外，GSA7同源物APG7（酿酒酵母自噬所需的蛋白质）能够拯救GSA7。我们对GSA7的人类同源物进行了测序，并显示了酵母和人类蛋白质之间的许多相同区域。其中两个区域与泛素激活酶E1（UBA1、UBA2和UBA3）家族的假定ATP-结合域和催化位点对齐。当这两个位点中的任何一个发生突变时，产生的突变体[Gsa7（DeltaATP）-HA和Gsa7（C518S）-HA]无法拯救Gsa7细胞。我们提供证据表明，Gsa7-HA与25-30 kDa蛋白形成了硫酯键。在表达Gsa7（DeltaATP）-HA的细胞或表达Gsa7-HA的细胞中未观察到这种结合物。我们的结果表明，这种独特的E1样酶是同型膜融合所必需的，这是液泡隔离过氧化物酶体的晚期事件。

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数字

图1
图1
双亲GS115和GS115营养适应期间的过氧化物酶体降解和氮饥饿期间的蛋白质降解gsa7–1突变体。细胞在甲醇诱导培养基中培养24–36小时。在葡萄糖（2%）适应的0和6小时，制备无细胞提取物，并按照材料和方法中的描述测定乙醇氧化酶（AOX）和甲酸脱氢酶（FDH）的活性。这些值代表三次或三次以上测定的平均值±SD，并以0小时测得的活性百分比表示。按照材料和方法中的描述，测量氮饥饿期间细胞蛋白质的降解。细胞蛋白被放射性标记，然后在含有组氨酸和氮（Fed）或缺乏氨基酸和氮（Starved）的培养基中追踪。在追逐的2–24小时内测量TCA可溶性放射性的产生，并通过线性回归确定降解率。这些值表示为线性回归的每小时退化百分比±SE。
图2
图2
的形态学gsa7型和gsa7型葡萄糖适应期间的Δ细胞。gsa7型Δ细胞在甲醇（A）和gsa7型,gsa7型Δ和gsa7型用正常细胞转化的Δ细胞GSA7标准基因(gsa7Δ/gsa7)在甲醇诱导培养基中培养，然后适应葡萄糖培养3 h（B–D）。收集细胞，用高锰酸钾固定，并按照材料和方法中的描述制备电子显微镜。N、 细胞核；五、 液泡；P、 过氧化物酶体。棒，0.5μm。
图3
图3
核苷酸和预测的氨基酸序列GSA7.GSA7型用pYWP7-1（包含4.5kb的基因组DNA插入）、pYWP7-4（包含4.1kb的基因DNA插入）和pGSA7HA（包含2.3kb的ORFGSA7标准C末端有HA表位）和pWP-SWI3（包含原始4.1-kb基因组DNA的1.5-kb 3′片段）。pGSA7HA(Bgl公司一） 在GSA7标准带有的基因Bgl公司我要促进插入gsa7型轨迹。pGSA7HA(巴姆HI）在HIS4型带有的基因巴姆HI促进插入他的4轨迹。如前所述，对产生的转化子进行了拯救突变表型的能力分析（Yuan等。, 1997). 这个GSA7标准ORF编码989个氨基酸的蛋白质，分子量为71 kDa。这个GSA7标准序列的GenBank登录号为AF098976。
图3
图3
核苷酸和预测的氨基酸序列GSA7.GSA7型用pYWP7-1（包含4.5kb的基因组DNA插入）、pYWP7-4（包含4.1kb的基因DNA插入）和pGSA7HA（包含2.3kb的ORFGSA7标准C末端有HA表位）和pWP-SWI3（包含原始4.1-kb基因组DNA的1.5-kb 3′片段）。pGSA7HA(Bgl公司一） 在GSA7标准带有的基因Bgl公司我要促进插入gsa7型轨迹。pGSA7HA(巴姆HI）在HIS4型带有的基因巴姆HI促进插入他的4轨迹。如前所述，对产生的转化子进行了拯救突变表型的能力分析（Yuan等。, 1997). 这个GSA7标准ORF编码989个氨基酸的蛋白质，分子量为71 kDa。这个GSA7标准序列的GenBank登录号为AF098976。
图4
图4
救援gsa7型和gsa7型Δ由Gsa7p表示。gsa7型和gsa7型用pGSA7HA稳定转化Δ细胞(巴姆HI）。那些在他的土地上生长的殖民地负极用HA表位抗体进行Western blotting筛选Gsa7-HA表达的培养基。未转换的(gsa7型和gsa7型Δ）和转换(gsa7型/GSA7标准和gsa7型Δ/GSA7标准)然后在甲醇诱导培养基中培养细胞，使其适应葡萄糖6小时。AOX活性表示为0小时测得的活性的百分比，并表示四次或多次测定的平均±SD。在氮饥饿过程中，细胞蛋白质的降解如先前在材料和方法中所述进行。细胞蛋白被放射标记，然后在缺乏组氨酸和氮的饥饿培养基中追踪。在追踪的2–24小时测量TCA可溶放射性的产生。
图5
图5
制备和表征GSA7标准淘汰赛。这个酿酒酵母ARG4基因被插入Hin公司dIII和Bgl公司ORF内的II个站点GSA7标准. TheARG4公司插入包括ORFARG4公司5′非编码区的1300bp和3′非编码区域的500bp。5′非编码区包括ARG4公司启动子，而3′非编码区可能缺少启动子序列，因为ARG4公司距离2200 bp。此外，3′非编码区可能含有转录终止子。敲除片段（5.1 kb）通过以下方法从穿梭载体中切下阿帕我和Sca公司我消化并用于转化PPF1(his4，arg4). 稳定Arg+分离出转化子，政府支持局通过直接集落分析鉴定突变体，并通过PCR证实该构建物与基因组DNA的重组。从GS115和gsa7型Δ和插入位置ARG4公司用插入物内部（b和d）和外部（a和c）的引物通过PCR分析验证基因。预期的5.0kb（a→b）、6.1kb（a→c）和3.3kb（a→d）的片段与ARG4公司基因被插入GSA7标准轨迹gsa7型Δ单元。
图6
图6
的比较GSA7标准基因。的氨基酸序列GSA公司7来自巴氏杆菌（见图3B）与APG7型从酿酒酵母、和GSA7标准从对齐智人（HsGSA7标准). Hs序列GSA7标准GenBank登录号为AF094516。在序列的许多区域内，用虚线表示的氨基酸一致性很明显。插入由点表示的间隙以优化氨基酸排列。
图7
图7
补充gsa7型通过APG7.gsa7型用pGSA7HA稳定转化细胞(巴姆HI）（车道A和B），pGSA7HA(Bgl公司一） （C车道）或pAPG7HA(巴姆HI）（通道D–F）位于各自内源性启动子后面。用HA表位单克隆抗体进行Western blotting，评估Gsa7-HA和Apg7-HA的表达。表达和不表达Gsa7-HA和Apg7-HA的克隆在甲醇诱导培养基中生长，并适应葡萄糖6 h。细胞被裂解，提取物被检测AOX活性（见材料和方法）。这些数字表示6小时时存在的AOX活性相对于0小时时测量的AOX活性的百分比。
图8
图8
补充gsa7型通过正常和突变形式的重组Gsa7-HA。（A） GSA7、APG7和HsGSA7蛋白与三种泛素激活酶（UBA1、UBA2和UBA3）对齐。指出了假定催化结构域（C518）和ATP结合区（K327–R342）周围的氨基酸排列。在这些区域内，用虚线表示的氨基酸特性很明显。插入由点表示的间隙以优化氨基酸排列。（B）gsa7型细胞被稳定转化为GSA7-HA标准,gsa7型(ΔATP）,gsa7（C518S）、和gsa7（C562S）然后细胞在甲醇诱导培养基中生长，然后适应葡萄糖6小时。制备细胞提取物，并进行AOX分析。结果值以0小时测得的放射性百分比表示，并代表四次或四次以上测定的平均值±SD。（C） 将在葡萄糖适应3小时制备的细胞提取物等分样品溶解在2%SDS中并煮沸3分钟（−DTT），或溶解在2%含有1.5%DTT的SDS中并且煮沸5分钟（+DTT）。通过SDS-PAGE分离蛋白质。转移到硝化纤维素后，使用识别HA表位的多克隆抗体鉴定表位标记的Gsa7蛋白。Gsa7-HA以72-kDa蛋白的形式迁移（箭头所示）。在～100 kDa（箭头）处观察到Gsa7-HA的硫酯偶联物。
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