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找到1个结果Sudit BS[作者]
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.2016年3月11日；291(11):5664-5675.
doi:10.1074/jbc。M115.696849。 Epub 2016年1月21日。

PKD1通过丝氨酸491磷酸化抑制AMPKα2并损伤骨骼肌细胞的胰岛素信号

金伯利·A·考夫兰 1, 鲁迪·J·瓦伦丁 2, 贝拉·苏迪特 1, 凯瑟琳·艾伦 1, 尤西·达贡 三, 芭芭拉·卡恩 三, 尼尔·B·鲁德曼 1, 阿西什·K·萨哈 4
附属公司

PKD1通过丝氨酸491磷酸化抑制AMPKα2并损伤骨骼肌细胞的胰岛素信号

金伯利·A·考夫兰等。 生物化学杂志. .

摘要

AMP-activated protein kinase（AMPK）是一种能量敏感酶，其活性在胰岛素抵抗时受到抑制。最近研究表明，暴露于高糖浓度下会增加AMPKα1/α2亚单位Ser（485/491）的磷酸化；然而，它这样做的机制尚不清楚。二酰甘油（DAG）也在暴露于高糖的肌肉中增加，它激活了许多信号分子，包括蛋白激酶（PK）C和PKD1。我们试图通过引起骨骼肌细胞中Ser（485/491）磷酸化来确定PKC或PKD1是否参与AMPK的抑制。用PKC/D1激活剂佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）处理C2C12肌管，PMA作为DAG模拟物。这导致了AMPK-Ser（485/491）磷酸化的剂量和时间依赖性增加，这与AMPKα2活性降低～60%有关。磷酸缺陷型AMPKα2突变体（S491A）的表达阻止了PMA诱导的AMPK活性降低。广泛的PKC抑制剂Gö6983部分阻止了丝氨酸磷酸化和AMPK活性的抑制，而特定的PKD1抑制剂CRT0066101则完全阻止了这一过程。PKD1的基因敲除也阻止了AMPK的Ser（485/491）磷酸化。抑制先前确定的在此位点磷酸化AMPK的激酶（Akt、S6K和ERK）并不能阻止这些事件的发生。PMA治疗也导致通过Akt的胰岛素信号传导受损，而PKD1的抑制可以阻止这种情况的发生。最后，重组PKD1在无细胞条件下在Ser（491）磷酸化AMPKα2。这些结果确定PKD1是AMPKα2 Ser（491）的一种新型上游激酶，在肌肉细胞的胰岛素信号传导中起负作用。

关键词：AMP活化激酶（AMPK）；Akt PKB；丝氨酸485/491；胰岛素抵抗；蛋白激酶C；蛋白激酶D（PKD）；骨骼肌。

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数字

图1。
图1。
PMA治疗时间和剂量依赖性刺激血清AMPK磷酸化485/491在C2C12肌管中。肌管用10–100 n米PMA持续30分钟(A类,B类)或50 n米PMA持续5–180分钟(C类,D类). 细胞被裂解，蛋白质表达和磷酸化被Western blot分析。典型的Western印迹(A类,C类)及其密度分析(B类,D类)如图所示。结果为平均值±S.E(n个=每治疗3–6次）。所有实验均一式三份。*，第页与对照组相比<0.05。
图2。
图2。
PKD抑制阻止PMA诱导的AMPK-Ser磷酸化485/491在C2C12肌管中。用非特异性PKC抑制剂Gö6983（5μ米) (A类,B类)或特定PKD抑制剂CRT0066101（10μ米) (C类,D类)PMA处理前1小时（50 n米，30分钟）。细胞被裂解，蛋白质表达和磷酸化被Western blot分析。典型的Western印迹(A类,C类)及其密度分析(B类,D类)如图所示。结果为平均值±S.E(n个=每治疗3–6次）。所有实验均一式三份。*，第页与对照组相比<0.05；†，第页与PMA治疗相比<0.05。
图3。
图3。
PMA治疗可降低C2C12肌管中的AMPK活性，而PKC和PKD的抑制或S491A AMPKα2的表达可阻止这种降低。C2C12肌管用非特异性PKC抑制剂Gö6983（5μ米) (A类)或特定PKD抑制剂CRT0066101（10μ米) (C类)PMA处理前1小时（50 n米，30分钟）。通过SAMS肽分析测定AMPKα2活性。B类和D类显示AMPKα2活性与血清485/491磷酸化。E类用FLAG标记的WT AMPKα2或S491A AMPKβ2转染C2C12细胞。48小时后，用PMA处理细胞（50 n米，30分钟），然后使用抗FLAG抗体进行裂解和免疫沉淀。蛋白质磷酸化和表达通过Western blot分析。使用SAMS肽分析法测定AMPK活性。结果为平均值±S.E(n个=每次治疗3-6次）。*，第页与对照组相比<0.05；†，第页与PMA治疗相比<0.05。
图4。
图4。
PKD1敲除阻止PMA诱导的AMPK-Ser磷酸化485/491在C2C12肌管中。用打乱或PKD1 siRNA转染C2C12肌管。48小时后，用PMA（50 n）处理肌管米，30分钟）。细胞裂解，蛋白质表达和磷酸化通过Western blot分析。典型的Western印迹(A类)及其密度分析(B类)如图所示。结果为平均值±S.E(n个=每治疗3–6次）。所有实验均一式三份。*，第页与对照组相比<0.05；†，第页与PMA治疗相比<0.05。
图5。
图5。
Akt、S6K或ERK的抑制不能阻止PMA诱导的AMPK-Ser磷酸化485/491.用PI3K/Akt抑制剂沃特曼（100 n）处理肌管米) (A类)mTOR/P70S6K抑制剂雷帕霉素（100 n米) (B类)或ERK抑制剂U0126（5μ米) (C类)PMA处理前2小时（50 n米，30分钟）。细胞裂解，蛋白质表达和磷酸化通过Western blot分析。显示了典型的Western blot及其密度分析。结果为平均值±S.E(n个=每治疗3–6次）。所有实验均一式三份。*，第页与对照组相比<0.05；†，第页与PMA治疗相比<0.05。
图6。
图6。
PMA刺激PKD1损害胰岛素信号传导。 A类和B类，C2C12肌管接受或不接受Gö6983（5μ米)或CRT0066101（10μ米)PMA处理前1小时（50 n米，30分钟），然后进行胰岛素刺激（100 n米，15分钟）。C类和D类用打乱或PKD1 siRNA转染C2C12肌管。48小时后，用PMA（50 n）处理肌管米，30分钟），然后进行胰岛素刺激（100 n米，15分钟）。细胞被裂解，Akt、AMPK、PKD1和IRS-1磷酸化通过Western blot分析。代表性斑点(A类,C类)和量化(B类,D类)如图所示。*，第页与对照组相比<0.05；†，第页与胰岛素治疗相比<0.05。
图7。
图7。
S491A AMPKα2的表达通过Akt阻止PMA诱导的胰岛素信号损伤。用WT-AMPKα2或S491A AMPKα2转染C2C12细胞。48小时后，用PMA处理细胞（50 n米，30分钟），然后进行胰岛素刺激（100 n米，15分钟）。然后对细胞进行裂解，并在Ser473Western blot分析。显示了具有代表性的印迹和定量。结果为平均值±S.E(n个=每治疗3–6）。*，第页与WT+胰岛素相比<0.05。
图8。
图8。
重组PKD1在血清中磷酸化AMPK485/491在无细胞测定中。重组AMPKα2/β1/γ1与重组PKD1或重组Akt孵育，如“实验程序”所述491Western blot检测。所示的代表性图像来自单个凝胶/曝光。A类，PKD和Akt的共有底物基序与AMPKα2的486–491残基排列(B类).n个=每组3人。所有实验均一式三份。
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