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.2005年5月；3（5）：e159。
doi:10.1371/journal.pbio.0030159。 Epub 2005年4月26日。

DRG神经元对ETS转录因子信号反应的发育开关

西蒙·希彭迈耶 1, 埃琳·弗里塞林, 马库斯·西格里斯特, 托马斯·波特曼, 西莉亚·莱恩, 大卫·R·拉德尔, 西尔维娅·阿伯
附属公司

DRG神经元对ETS转录因子信号反应的发育开关

西蒙·希彭迈耶等。 公共科学图书馆生物. 2005年5月.

摘要

目的衍生因子在背根神经节（DRG）感觉和脊髓运动神经元亚群中诱导了Pea3亚家族的两种ETS转录因子。它们的表达控制着神经元分化的后期，如靶细胞侵袭和分支。在这里，我们表明ETS基因表达的延迟开始是正常感觉神经元分化的必要条件。我们在小鼠中提供了遗传证据，证明DRG感觉神经元中早熟ETS的表达会干扰轴突投射、末端分化标记物的获取及其对神经营养支持的依赖。总之，我们的研究结果表明，DRG感觉神经元表现出一种时间性的发育转换，这种转换可以通过神经元成熟过程中对ETS转录因子信号的不同反应来揭示。

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图1
图1。更换第81页通过EWS-项目3
（A） 的生成第81页EWS-项目3突变小鼠。以上是第81页类比[14]，同源重组靶区的基因组位点。外显子1-4显示为淡蓝色框第81页外显子2的起始密码子表示为ATG。用于检测同源重组的探针显示为灰色方框。以下是替换第81页通过EWS-项目3通过整合EWS-项目3在带有第81页外显子2的位点（与[14]相似）。（B） PCR和Southern blot分析第81页EWS-项目3野生型(+/+)，杂合子(+/−)和纯合子(−/−)基因组DNA检测突变等位基因。PCR引物对（EWS-Pea3ki）用于特异性检测重组等位基因，外显子2中的引物对用于检测野生型等位基因的存在[14]。（C–E）E16.5野生型（C）腰椎DRG神经元Er81表达分析，第81页−/−（D） 、和第81页EWS-Pea3/−（E） 胚胎。每个面板右下角的插图显示了各自DRG中的Isl1表达。（F–H）PV在E16.5野生型（F）腰椎DRG中的表达，第81页−/−（G） 、和第81页EWS-Pea3/−（H） 胚胎。以等增益强度进行共焦扫描。（J） 包含五个一致ETS DNA结合位点的最小报告构建物中荧光素酶表达的转录激活(GCCGGAAGC；[18,19]）和Er81瞬时转染后的最小TK启动子(n个≥ 7; 3.03±0.66）或EWS-Pea3(n个≥ 7; 20.3 ± 2.7). 相对荧光素酶活性归一化为对照（Con）。比例尺：80μm。
图2
图2。Ia本体感觉传入投射入脊髓腹侧的抢救第81页EWS第3页突变体
（A–F）PV腰椎L3水平中央投射的形态学分析+在P0.5（A–C）或P5（D–F）野生型（A和D）的单个背根上应用荧光标记的右旋糖酐后，DRG神经元（A-C）或所有DRG感觉传入，第81页−/−（B和E），以及第81页EWS-Pea3/−（C和F）小鼠。红色虚线表示脊髓处于中间水平。（G–I）P0.5野生型（G）腹角vGlut1免疫细胞化学分析，第81页−/−（H） 、和第81页EWS-Pea3/−（一） 老鼠。（A）中的黄色虚线框表示（G–I）中所示图像的大小。（J–L）在野生型中观察到的Ia本体感觉传入投射（蓝色）进入腹侧脊髓的形态拯救的示意性总结图（J），第81页−/−（K） ，以及第81页EWS-Pea3/−（五十） 老鼠。用灰色虚线表示的DRG；运动神经元以黑色显示。比例尺：（A–C），150μm；（D–F），160μm；（G-I），70μm。
图3
图3。早熟表达时感觉传入投射建立的缺陷EWS-项目3DRG神经元
（A-C和G-I）野生型（A-C）脊髓感觉传入投射（绿色）的可视化和陶（Tau）EWS-项目3/+岛屿1Cre公司/+E13.5（A、C、G和I）和E16.5（B和H）的（G-I）胚胎通过Cre重组介导激活mGFP表达陶（Tau）轨迹（A、B、G和H）或通过您的1spGFP基因转基因（C和I；[25]）。灰色箭头表示脊髓传入投射的正常模式，而红色箭头表示脊髓外侧边缘的感觉传入异常积聚陶（Tau）EWS-项目3/+岛屿1Cre公司/+胚胎。（D-F和J-L）分析野生型（D-F）和陶（Tau）EWS-项目3/+岛屿1Cre公司/+（J–L）胚胎在E16.5通过Cre重组介导激活mGFP（D、E、J和K）表达陶（Tau）基因座。（F和L）显示出口风险3使用原位杂交在梭内肌纤维中表达（显示[E和K]的连续切片）。（M–Q）E13.5野生型（M）和陶（Tau）EWS-项目3/+岛屿1Cre公司/+将荧光标记的右旋糖酐（绿色）注射到一个DRG（腰椎L3级）后的（O和Q）胚胎。（M和O）的共焦扫描平面如（N）所示。插入（O）也显示在更深的共焦扫描平面（P和Q），以显示异常轴突投影。比例尺：（A和G），60μm；（B和H），80μm；（C和I），100μm；（D和J），160μm；（E、F、K和L），70μm；（M、O和Q），240μM。
图4
图4。提前表达EWS-Pea3的DRG神经元体外神经营养素非依赖性突起生长
E13.5来自野生型（A、B和C）的腰椎DRG，陶（Tau）EWS-项目3/+岛屿1Cre公司/+（D、E和F），或Bax公司−/−（G、H和I）胚胎在没有神经营养支持（A、D和G）或在NGF（B、E和H）或NT-3（C、F和I）存在的情况下培养48小时，对其进行染色，以观察神经丝的表达，从而观察轴突延伸。比例尺：130μm。
图5
图5。表达EWS-Pea3的DRG神经元等时依赖神经营养素生存
E14.5腰部DRG来自陶（Tau）百万绿色荧光蛋白/+光伏Cre公司/+（A和B）和陶（Tau）EWS-项目3/+光伏Cre公司/+（C和D）胚胎在没有神经营养支持（A和C）或NT-3（B和D）的情况下培养48小时，对其进行染色，以观察神经丝（红色）和LacZ（绿色）的表达，从而观察轴突延伸和PV表达本体感受传入的存活。比例尺：150μm。
图6
图6。早熟ETS信号转导导致DRG神经元Trk受体表达缺失和存活率增加
（A–C和G–I）的原位杂交分析神经生长因子受体（A和G），TrkB型（B和H），以及TrkC公司野生型（A–C）和E16.5腰椎DRG中（C和I）的表达陶（Tau）EWS-项目3/+岛屿1Cre公司/+（G-I）胚胎。（D–F和J–L）野生型（D）腰椎DRG分析，陶（Tau）百万绿色荧光蛋白/+Isl岛Cre公司/+（E和F），以及陶（Tau）EWS-项目3/+岛屿1Cre公司/+（J、K和L）胚胎用于（1）TUNEL（绿色；D和J）在E13.5处的神经元细胞死亡，（2）LacZ（蓝色）全染色在E16.5处的细胞存活和增殖（E和K；显示腰椎水平L1和L2），以及（3）BrdU（绿色）/LacZ（红色）双标记（F和L）。（M和N）定量分析(n个与野生型水平相关的凋亡事件平均数的≥3个独立实验）如（M）所示，（N）的神经元存活率为连续切片上定量的L1至L5腰椎水平野生型DRG的百分比。（O） E16.5野生型（wt）和陶（Tau）EWS-项目3/+岛屿1Cre公司/+使用以下抗体的（mut）胚胎：Akt、p-Akt（Ser473）、CREB、p-CREB（Ser133）、Bax、Bcl2和Bcl-xl。（P） 右侧显示了相对于野生型蛋白质水平的定量分析（百分比）(n个＝3个独立实验）。比例尺：（A–C和G–I），35μm；（D和J），40μm；（E和K），200μm；（F和L），50μm。
图7
图7。诱导早熟或等慢性ETS信号转导的基因表达分析
（A–H）分析TrkC公司野生型（A和E）E16.5腰椎DRG的原位杂交（A–D）表达，或免疫组织化学（E–H）的钙调素（红色）和LacZ（绿色）表达，陶（Tau）EWS-项目3/+岛屿1Cre公司/+（B和F），二81EWS-Pea3/−（C和G），以及陶（Tau）EWS-项目3/+光伏Cre公司/+（D和H）胚胎。（一） 说明DRG神经元（B和F；E10–E11，即细胞周期退出后不久，E9.5–E10）中EWS-Pea3表达的早熟诱导后TrkC（红色箭头，下调）和Calretinin（绿色箭头，上调）表达的解除调节的总图。相反，内源性第81页基因座（C和G；E12.5–E13）或通过Cre重组酶表达光伏激活基因座的晚期表达陶（Tau）位点（D和H；E14.5）不干扰TrkC公司和钙调素（以灰色显示）。比例尺：（A–D），65μm；（E–H），80μm。
图8
图8。早熟ETS信号诱导细胞基因表达的自主变化
（A–D）TrkA（A和C；绿色）或TrkC（B和D；绿色）和LacZ（红色）在E16.5腰椎DRG中的表达陶（Tau）百万绿色荧光蛋白/+血红蛋白9Cre公司/+（A和B）和陶（Tau）EWS-项目3/+血红蛋白9Cre公司/+（C和D）胚胎。（E–L）Calretinin（绿色）、LacZ（红色）和Isl1（F、J、H和L；蓝色）在E16.5肱骨（E–H）和腰椎（I–L）DRG中的表达陶（Tau）百万绿色荧光蛋白/+血红蛋白9Cre公司/+（E、F、I和J）和陶（Tau）EWS-项目3/+血红蛋白9Cre公司/+（G、H、K和L）胚胎。比例尺：（A–D），80μm；（E–L），70μm。
图9
图9。进展性神经元规范与ETS转录因子信号传导反应的发育转变相平行
示意性总结图说明了在DRG神经元规范化过程中适时上调转录因子表达对神经元分化和电路组装后期的重要性。（A–D）的表达式EWS-项目3从内源性第81页位点可以修复在第81页−/−小鼠，本体感觉传入纤维（A、B和D）中TrkC（绿色）或钙调素（CR；灰色）的表达没有变化。相反，早熟的ETS信号导致DRG神经元投射建立的严重缺陷，伴随着不适当的基因表达变化（C；CR（红色）上调和TrkC（灰色）下调）。（E） 本体感觉神经元进行性规范期间的早熟ETS信号（红色）导致异常神经元分化（红色虚线）。相反，ETS转录因子信号（黑色）的等时、靶向诱导（绿色；外周信号）启动可诱导适当的末端神经元分化（蓝色）。
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