组蛋白去甲基酶PHF8通过表观遗传上调FOXA2促进神经内分泌前列腺癌进展

动物和实验程序

所有涉及动物的实验均按照国际法（EEC理事会指令86/609，OJ L 358）进行。1987年12月12日；《实验动物的护理和使用指南》，美国国家研究委员会，1996年），并由陆军医科大学动物护理和使用委员会批准。转基因TRAMP（转基因小鼠前列腺腺癌，C57BL/6）和Phf8（第8页）5～6周龄的敲除小鼠取自南京大学（中国江苏南京）模型动物研究中心。这些动物被安置在陆军医科大学大坪医院实验动物中心（中国重庆）。通过交叉口Phf8（第8页）敲除雌性小鼠(Phf8（第8页） ^X−/−)TRAMP雄性小鼠，Phf8（第8页）敲除TRAMP小鼠(Phf8（第8页）‐KO；TRAMP）。第12周处死小鼠(n个 = 每组5个），25(n个 = 每组5个），37(n个 = 每组8个），以及42个(n个 = 每组7人）。

组织学分析

从处死动物身上解剖前列腺，将其固定在10%福尔马林中24小时，然后石蜡包埋进行苏木精-伊红（h&E）染色。前列腺病变（包括NEPC）的组织学分析基本上如前所述[26]. 简而言之，使用光学显微镜（BX53；日本东京奥林巴斯）对载玻片进行观察并拍照，两位认证病理学家（QM和HX）根据以下规范对组织学特征进行双盲分类：（1）正常组织（NT）；（2） 低级别PIN（前列腺上皮内瘤变，LGPIN）；（3） 高档PIN（HGPIN）；（4） 高分化腺癌；（5）未分化腺癌（UD‐腺癌，根据病理特征分类为NEPC病变：多形性、高核质比和腺分化缺失）。对于每个前列腺，以10倍放大率捕获十个随机场，并将其进一步分为四个象限。在每个象限中，使用最先进的组织学特征进行组织学分类。因此，确定了每个实验组中每个亚型病变的数量，并比较了不同实验组中不同亚型病变所占的百分比。

细胞系、试剂和患者衍生异种移植物（PDX）组织系

前列腺癌细胞系PC-3和LNCaP来自上海生物科学研究院细胞库（中国科学院上海），NE1.3细胞由李文良博士（休斯顿德克萨斯大学健康科学中心；MD Anderson癌症中心UT健康生物医学研究生院）。所有细胞均在经销商推荐的培养基中生长。PDX组织线（LTL-545和LTL-313HR）由Yuzhuo Wang教授（活肿瘤实验室，http://livingtomarlab.com/). 将标本皮下移植到NPG小鼠体内（北京维塔尔生物科技有限公司，中国北京）。将移植的肿瘤从处死的小鼠上切下，用10%福尔马林固定，石蜡包埋进行免疫染色和检测。

siRNA转染与shRNA感染

使用siRNA（中国广东省广州市瑞宝生物科技有限公司）瞬时敲除细胞中的PHF8，并以打乱的siRNA作为对照。针对菲律宾法郎如下所示：si菲律宾法郎‐1（CCGGAGAGATGCGAACCGTA和CAGCCTTAACATCGAGATGCA）；硅菲律宾法郎‐2（TCGGCGAAACCAAGAGAGAGCAAA和CAGGTGATGAAGACGAATTT）。一般来说，siRNAs（150 n米)根据制造商的协议（Thermo Fisher，Waltham，MA，USA），使用Lipo2000将其转染到500万个细胞中，并在转染后48小时对细胞进行分析。为了提高敲除效率，将四个各自的特异性siRNA合并用于转染。为了通过使用shRNA感染稳定击倒，菲律宾法郎shRNA（靶向序列：GCTCTTTCCAGAAAGCAAAGT）被克隆到pYr‐LVsh‐EGFP‐Puro载体（长沙盈润生物技术有限公司，中国湖南省长沙市）中。PC‐3、LNCaP和NE1.3细胞感染EV（空载体作为对照）或菲律宾法郎shRNA慢病毒和嘌呤霉素用于筛选感染细胞。

体内肿瘤发生测定

PC-3电池（1×10⁷每50μl）含（sh菲律宾法郎)或无（EV）感染菲律宾法郎shRNA与Matrigel（1:1）混合，然后皮下注射到6至7周龄裸鼠的侧翼。每2天记录肿瘤的大小，并使用长度×宽度公式计算体积²/2.由于pYr‐LVsh‐Puro载体包含EGFP序列以及来源于EV和sh的异种移植瘤，因此使用全身荧光评估最终肿瘤大小第8页可使用全身荧光成像系统检测PC-3细胞（Maestro体内成像系统；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市PerkinElmer）。将移植的肿瘤解剖、称重，用10%福尔马林固定，石蜡包埋进行免疫染色检查。评估肺转移、EV和sh的差异菲律宾法郎PC-3电池（3×10⁶每50μl）注射到6至7周龄裸鼠的尾静脉中，并让肿瘤生长19天，然后处死小鼠。肺被解剖，用PBS冲洗，石蜡包埋切片。

患者和组织样本

所有涉及人类参与者的程序都是按照机构研究委员会的道德标准以及1964年《赫尔辛基宣言》及其后来的修正案或类似的道德标准进行的。所有患者样本均由病理科采集，并经陆军医科大学大坪医院研究伦理委员会批准，并获得每位患者的书面知情同意书。为了评估PHF8在ADT诱导的NED中的作用，从我们的数据库中专门选择了7名患者作为队列。所有这些患者在前列腺穿刺活检后均接受ADT和阿比特龙、恩扎鲁胺或多西紫杉醇治疗，治疗后确定NEPC或NE区域。这些患者的临床信息见补充材料表S1（第一阶段）为了确定腺癌、CRPC-Adeno和NEPC组织中PHF8和FOXA2的水平，前文描述了一种腺癌组织微阵列（TMA）[27]，一个由王玉卓教授善意提供的PDX组织微阵列，以及另外六个CRPC-腺组织（补充材料，表S2系列)使用我们队列中的上述七种NEPC或NED组织。总共包括59例腺癌患者、13例CRPC-Adeno患者和10例NEPC或NED患者。

免疫组织化学染色

将嵌入标本切片，安装在玻璃载玻片上，然后按照前面所述进行免疫染色[27]. 抗AR的一级抗体（ab108347，1:200；Abcam，Cambridge，MA，USA）、PSA（sc‐7316，1:50；Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX，USA，TX）、SYP（17785‐1‐AP，1:400；Proteintech，Rosemont，IL，USA；CD56（14255‐1­AP，1:1600；Proteitech）、CgA（60135‐1g，1:600；Protientech）、PHF8（ab36068，1:200，Abcam）、Large‐T（554149，1:100；使用了BD，Lake Franklin，NJ，USA）和FOXA2（sc374376，1:50；Santa Cruz Biotechnology）。如前所述对染色强度进行评分[28]由认证病理学家（QM和HX）进行，并使用光学显微镜进行成像（BX53；日本东京奥林巴斯）。

免疫荧光染色

在福尔马林固定的石蜡包埋切片上进行CK5和CK18或PHF8和FOXA2的免疫荧光染色。将切片与针对CK5（ab52635，兔，Abcam，1:400）、CK18（66187‐1‐lg，小鼠，Proteintech，1:200）、PHF8（ab36068，兔，Abcam，1:200）和FOXA2（sc374376，小鼠，Santa Cruz Biotechnology，1:50）的一级抗体孵育。用于检测的二级抗体是与Alexa Fluor 488（1:200；中国北京中山金桥生物科技有限公司）结合的山羊抗兔抗体和与Alexa-Fluor 594（1:200，中山金桥生技有限公司）接合的山羊抗鼠抗体。在37°C下用DAPI对切片进行15分钟的复染（KGA215；KeyGenBioTECH，中国江苏省南京市），并使用共焦显微镜（LSM700；Zeiss，Oberkochen，德国）获得图像。

细胞数估计

PC-3、LNCaP和NE1.3细胞感染或不感染菲律宾法郎shRNA和/或FOXA2公司将质粒接种到96孔板中。在指定的时间点，使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）分析评估细胞数量。简而言之，抽吸培养基并用PBS冲洗细胞，然后在37°C下应用CCK‐8试剂（10μl/孔）2小时。采用分光光度法测量450 nm处的吸光度（Bio‐Rad，Hercules，CA，USA）。

克隆测定

PC‐3细胞感染或不感染菲律宾法郎将有或无PHF8过度表达的shRNA和LNCaP细胞接种在每孔1000（PC-3）或2000（LNCaP）细胞的六孔板中，按指示处理，并在37°C下培养14天，每7天更换一次培养基。实验结束时，用甲醇固定细胞，用结晶紫染色，并计算菌落数。

Transwell分析

评估细胞迁移和侵袭在体外，我们使用了24孔Transwell腔室，有或没有Matrigel。有或无PC-3和LNCaP电池菲律宾法郎将shRNA胰蛋白酶化并以5×10的密度接种到顶室⁴每孔200μl Dulbecco改良Eagle培养基中的细胞数。底部腔室含有800μl培养基（10%胎牛血清）。在37°C下孵育24小时（PC-3）或48小时（LNCaP）后，用棉签小心地清除附着在膜顶部的细胞，而用10%福尔马林固定底部室中的细胞，并在室温下用结晶紫染色3分钟并计数。

伤口愈合分析

带有或不带有shRNA的PC-3细胞菲律宾法郎接种到六孔板中并培养24小时。使用无菌10μl移液管尖端在融合细胞单层中划痕，用PBS冲洗细胞一次，然后在无血清培养基中培养细胞。用倒置显微镜（CK40F200；奥林巴斯）在不同时间点（0、24和48小时）拍摄划痕图像。

荧光素酶检测

12孔板中的细胞转染1μgFOXA2公司‐Luc矢量，100 ng雷尼利亚荧光素酶载体及其质粒表达菲律宾法郎，使用脂多糖胺。将转基因细胞培养48 h，并将细胞裂解液用于双荧光素酶分析（E1910；美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。将10微升细胞裂解物装入96孔板中，并根据制造商的说明，使用Veritas Microplate光度计（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher）测量荧光素酶活性。雷尼利亚荧光素酶活性用于使转染效率正常化。

免疫印迹

通过SDS‐PAGE分离细胞裂解物，然后进行免疫印迹分析，如前所述[27,28]具有PHF8抗体（ab36068，1:1000；Abcam，美国马萨诸塞州剑桥市）、SYP抗体（17785‐1‐AP，1:2000；Proteintech，美国伊利诺伊州罗斯蒙特市）、CgA抗体（60135‐1lg，1:600；Proteitech）、CD56抗体（14255‐1AP，1:200；Proteiotech）、FOXA2抗体（ab256493，1:1000，Abcam）和β-actin抗体（3700s，1:5000；Cell Signaling Technology，美国马萨州波士顿市）。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析和定量聚合酶链反应（qPCR）

根据制造商的说明（53009；Active Motif，Carlsbad，CA，USA），使用磁性ChIP试剂盒进行ChIP分析。总之，细胞用1%甲醛固定；染色质通过酶消化破碎。抗PHF8（ab36068；Abcam）、H3K9me1（ab8896；Abcam）、H3 K9me2（ab1220；Abca姆）、H3+27me2（ab24684；Abcam2）和H4K20me1（ab9051；Abcam-）的抗体用于免疫沉淀。洗涤和反向交联后，沉淀的DNA被纯化并通过qPCR扩增。提取的RNA被反转录成cDNA，并在iCycle系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）中使用SYBR Green Master Mix（Invitrogen，Carlsbad，CA，US）进行qPCR。PCR数据使用GraphPad Prism（GraphPad-Software，San Diego，CA，USA）进行分析。所用PCR引物的序列列于补充材料表第3章.

RNA‐seq分析

从肿瘤组织中提取总RNA，所述肿瘤组织来源于Phf8（第8页）‐第37周使用Trizol试剂（Invitrogen）的KO TRAMP小鼠或对照TRAMP小鼠。RNA‐seq由上海NovelBio生物医药科技有限公司（中国上海）进行。每个样本包含来自每组三只小鼠的混合RNA，并与等量的RNA混合，以最小化样本之间的差异。利用HISAT2筛选RNA‐seq读取并映射到小鼠基因组（GRCm38，NCBI）[29]. HTSeq用于计算基因计数[30]. 利用DESeq2进行差异表达基因分析[31]根据以下标准：折叠变化>2或折叠变化<0.5；FDR<0.05。对来自Hallmark通路数据库的数据进行基因集富集分析（GSEA）[32]. 原始数据可以从GEO下载GSE157621标准(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE157621).

统计分析

所有统计分析均使用SPSS 19.0（IBM，Amonk，NY，USA）。数据以平均值±标准偏差表示。如果数据遵循正态分布，则通过t吨‐测试或配对t吨‐测试或χ²通过单因素方差分析，然后采用最小显著性差异法进行均值比较，分析各组间的差异。对于不符合正态分布的数据，使用了非参数统计检验。采用Kendall秩相关分析对PHF8和FOXA2的表达进行相关性分析。一P（P）小于0.05的值被认为具有统计学意义。

PHF8在NEPC发展中起重要作用，但不影响肿瘤的发生

这个Phf8（第8页）敲除雄性小鼠(博士8 ^−/年小鼠）按上述方法生成[33]. 与之前的观察结果一致Phf8（第8页）对大体形态表型或生育率没有影响（数据未显示）。此外，对25周龄、37周龄和53周龄对照组C57和Phf8（第8页） ^−/年雄性小鼠表明Phf8（第8页）敲除并不影响前列腺的发育，这表明PHF8在生理条件下对前列腺的稳态不是必需的（补充材料，图S1（第一阶段）A–C）。CK5（基底细胞的标志物）和CK18（管腔上皮细胞的标志物）的双重免疫荧光染色进一步证实了这一观察结果（补充材料，图S1（第一阶段）D–F）。

TRAMP小鼠模型已被广泛用于前列腺癌研究，因为它密切反映了人类前列腺癌的发病机制。随着病毒SV40癌蛋白在前列腺上皮中的转基因表达，TRAMP小鼠在10-12周龄时产生PIN，在18-20周龄时形成侵袭性前列腺癌[34,35]. 在它们的一生中，大约20%的TRAMP小鼠发展为NEPC[5]. 为了研究PHF8在前列腺癌发生和发展中的潜在作用，我们将女性Phf8（第8页）基因敲除小鼠(Phf8（第8页） ^X−/−)用雄性TRAMP小鼠获得雄性Phf8（第8页）敲除TRAMP小鼠（TRAMP/Phf8（第8页）‐KO）。然后我们比较了TRAMP中的前列腺病变/Phf8（第8页）‐第12、25和37周时，KO雄性小鼠和TRAMP雄性小鼠。前列腺病变分为正常、LGPIN或HGPIN、WD‐Adeno或UD‐Adeno，并按前述方法进行分析[36]. 同样根据之前的研究[26]我们将UD‐腺瘤归类为NEPC病变，因为我们的H&E染色显示UD‐）腺瘤病变中的细胞表现出NEPC样特征，包括多形性、高核质比和腺体分化缺失。图1A–C显示对照TRAMP和TRAMP前列腺病变的典型H&E染色/Phf8（第8页）分别在第12周、第25周和第37周对雄性小鼠进行KO，图1D至F显示每个阶段的相应病变状态。在两个TRAMP中均观察到LGPIN和HGPIN/Phf8（第8页）‐WT和TRAMP/Phf8（第8页）‐KO小鼠(n个 = 5） 第12周。25周时，两组均观察到腺癌病变(n个 = 5） 和37(n个 = 8） ，TRAMP略有增加/Phf8（第8页）‐科威特。有趣的是，虽然在一个TRAMP中发现了NEPC病变/Phf8（第8页）‐第25周（1/5）的WT小鼠和第37周（2/8）的两只TRAMP小鼠，没有TRAMP/Phf8（第8页）KO小鼠在同一时间段内出现NEPC损伤。即使在42周时，TRAMP中也未发现NEPC损伤/Phf8（第8页）‐KO小鼠(n个 = 7，数据未显示）。这些结果表明Phf8（第8页）特别阻止了NEPC的发展。为了进一步证实我们的H&E结果，我们对腺癌标记AR和NEPC标记SYP和CD56进行了免疫染色。AR阳性腺癌在对照组和Phf8（第8页）25周时敲除TRAMP小鼠（数据未显示）。然而，SYP和CD56阳性的NEPC仅见于TRAMP对照组，而在Phf8（第8页）‐第37周的KO小鼠（补充材料，图S2系列). 此外，在对照组小鼠中发现25周时有一只小鼠发生腹腔转移，37周时有三只小鼠发生九次转移（三次转移至肾脏，一次转移至肺部，两次转移至肝脏，两次移动至腹腔，一次移动至睾丸）。然而，未发现转移Phf8（第8页）同一时间段内的KO小鼠。与之前报告的结果一致[15]，几乎所有的转移灶都是NE癌，AR染色缺失，SYP、CD56和CgA染色阳性（补充材料，图第3章A–G）。值得注意的是，转移性NE中PHF8的水平要高得多（补充材料，图第3章H） 。这些结果综合起来表明，PHF8在NEPC的发展中起着重要作用，但与腺癌的发生和发展关系不大。

PHF8敲除削弱了NEPC特征

为了进一步研究PHF8对NEPC发育的影响，我们对来源于Phf8（第8页）‐KO和对照TRAMP小鼠（数据保存在GSE157621标准). 该分析确定了2092个差异表达基因（折叠变化>2，或折叠变化<0.5；FDR<0.05），TRAMP中623下降，1469上升/Phf8（第8页）‐KO小鼠（图2安培). 我们还比较了一组70个被视为NEPC标识符的基因中32个基因的表达[11]; 结果表明，肿瘤起源于Phf8（第8页）KO细胞更代表腺癌（图2B型). 使用AR信号特征“HALLMARK_ANDROGEN_RESPONSE”进行基因集富集分析（GSEA）的结果表明，PHF8的缺失影响AR信号通路（FDR）q个 = 0.043，图2摄氏度)年AR目标的变化证明了这一点Phf8（第8页）‐敲除肿瘤（图二维). 然后我们对常见的改变基因进行了生物信息学分析，这些基因在Phf8（第8页）使用Beltran发布的数据集，KO小鼠与对照TRAMP小鼠相比，NEPC患者中的表达显著上调等[11]. 值得注意的是，参与NEPC发展的两个重要转录因子ASCL1和FOXA2位列其中（图第二版). 与RNA‐seq结果一致，免疫染色显示FOXA2是NEPC发育的重要转录因子[15,19]在TRAMP衍生的肿瘤中显著减少/博士8‐KO小鼠（图2楼).

PHF8在NEPC细胞增殖和转移中的作用

考虑到包括神经母细胞瘤、NEPC、肺和膀胱小细胞癌在内的高级神经内分泌癌都更具侵袭性[37]，我们想确定PHF8是否在NEPC的肿瘤生长和侵袭性中发挥任何作用。为此，我们使用AR阴性、NEPC样PC-3细胞中的特定小发夹RNA（shRNAs）敲除PHF8（约70%）（图3A、B). 图中的结果3C、D表示击倒菲律宾法郎抑制细胞增殖和集落形成。这些发现被进一步证实体内数据显示菲律宾法郎使用shRNA减小了大小（图第三方)，体积（图第三层)和重量（图第三代移动通信)在裸鼠体内移植PC-3肿瘤。此外，Transwell和伤口愈合试验的结果表明，PHF8能够增强迁移和侵袭（图3H、I). 最后，我们向PC-3细胞注射（sh菲律宾法郎)或不带（EV）第8页敲除尾静脉并监测肺部肿瘤结节的数量和大小。当注射EV感染的PC-3细胞时，所有小鼠（10/10，100%）的肺部都出现了转移性结节。然而，6只注射了EV感染PC‐3细胞的小鼠（6/10，60%）的肺部不仅出现了较少而且较小的肿瘤结节菲律宾法郎（图3J型). 此外，在一个对照组中观察到一个肾肿瘤结节，但在注射了感染sh的PC‐3细胞的小鼠中没有观察到菲律宾法郎（图3公里). 这些数据也支持PHF8在NEPC细胞增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用的观点。此外，我们还研究了PHF8对腺癌细胞系（LNCaP）的影响。我们发现增殖（补充材料，图S4系列B） ，入侵（补充材料，图S4系列C） 和迁移（补充材料，图S4系列D） 当PHF8被shRNA（补充材料，图S4系列A） ●●●●。相反，PHF8过度表达使LNCaP细胞对抗雄激素治疗（比卡鲁胺和恩扎鲁胺治疗，补充材料，图S4系列G、 H），伴有NSE表达增加（补充材料，图S4系列E、 F）。这些观察结果还表明，PHF8的功能不是细胞类型特异性的。

PHF8通过转录上调FOXA2促进NEPC发育

为了研究PHF8调节NEPC发育的分子机制，我们首先检查了PHF8是否调节与NEPC发育相关的转录因子和调节因子的表达。为此，使用了两个具有NEPC表型的前列腺癌细胞系PC-3和NE1.3。当这些细胞用第8页特异性小干扰RNA（siRNAs），两者的mRNA水平菲律宾法郎和FOXA2公司而其他基因则没有显著下调（图4A、B类). 免疫印迹分析发现菲律宾法郎不仅显著下调了PHF8和FOXA2的水平，还导致NEPC标记物SYP、CD56和CgA的显著降低（图4C、D). 此外，免疫荧光分析显示，FOXA2和PHF8共同定位于细胞核中，并且在菲律宾法郎击倒细胞（图第四版). 与此一致的是，IHC染色还显示，在来源于shRNA介导的PC-3细胞的肿瘤中，FOXA2和NEPC标记物（SYP和CD56）减少菲律宾法郎击倒（图4英尺). 由于PHF8的敲除和过度表达下调和上调了FOXA2公司启动子调节荧光素酶活性（图4G，高)，我们得出结论，PHF8转录调节FOXA2表达。更重要的是，染色质免疫沉淀试验表明菲律宾法郎击倒还降低了PHF8的占用率FOXA2公司启动子，在启动子区域同时增加抑制性组蛋白标记物H3K9me1、H3K9 me2、H3K27me2和H4K20me1FOXA2公司基因（图4I型)，表明PHF8以脱甲基酶活性依赖的方式上调FOXA2的表达。最后，我们证明了在感染sh的PC-3和NE1.3细胞中过表达FOXA2第8页能够挽救NEPC标记SYP、CgA和CD56（图4J、K)以及菲律宾法郎击倒（图4升，M)表明PHF8主要或至少部分通过上调FOXA2促进NEPC的发展。

PHF8和FOXA2可以作为NEPC的生物标志物

为了探讨PHF8在NEPC中的临床意义，我们首先分析了菲律宾法郎在可公开获取的大型数据库“癌症基因组图谱”（TCGA；http://www.cbioportal.org)发现NEPC队列中约30%的患者菲律宾法郎放大（图5A级)，为NEPC中PHF8水平升高提供了分子解释。然后，我们比较了用阿比特龙、恩扎鲁胺或多西紫杉醇治疗前后收集的七个配对前列腺癌标本中PHF8和FOXA2的水平。值得注意的是，免疫染色显示，所有七个肿瘤在治疗前均为腺癌，AR和PSA染色均为阳性，SYP、CD56和CgA染色为阴性，而大多数肿瘤在ADT后AR和PSA-阴性，SYP-、CD56、CgA阳性（补充资料，图第5页A） ●●●●。代表性免疫染色（图5亿)和总结结果（图5C、D)显示ADT诱导的NEPC中PHF8和FOXA2水平升高。为了进一步证实这一观点，我们通过IHC比较了不同患者来源异种移植物（PDX）样本中PHF8和FOXA2的水平。为了避免任何实验变化，我们放置了NEPC型（以SYP、CD56和CgA染色阳性为特征，AR染色阴性为特征）PDX标本和腺癌型（以SYP、CD56、CgA着色阴性，AR染色阳性为特点；补充材料，图第5章B） 患者样本放在同一张玻片上，并用PHF8和FOXA2抗体进行免疫染色。补充材料，图第5章显示NEPC病灶中PHF8和FOXA2的水平均远高于腺癌。同样，当对NEPC PDX（LTL-545）和CRPC PDX组织（LTL-313HR，其特征是SYP、CD56和CgA染色阴性，AR染色阳性）进行类似实验时，NEPC中PHF8和FOXA2的水平也高于CRPC。最后，59例腺癌、13例CRPC-Adeno和10例NEPC或NED标本中PHF8和FOXA2染色的IHC评分表明PHF8的表达（图第五版)和FOXA2（图5楼)NEPC组织比腺癌（Adeno）和CRPC-Adeno组织高很多。这些发现与Beltran公共数据集中NEPC和CRPC样本中PHF8和FOXA2的表达一致等[11]（补充材料，图S6系列A、 B）。此外，PHF8的表达与FOXA2的表达呈正相关（补充材料，图S6系列C） ●●●●。此外，我们研究了42例前列腺癌标本中PHF8和FOXA2的表达与病理分级（Gleason评分）的关系（补充资料，图S6系列D–H）。我们的结果显示，与低级别肿瘤（Gleason评分小于或等于7）相比，PHF8（补充材料，图S6系列D–F）和FOXA2（补充材料，图S6系列E–G）在Gleason评分较高的肿瘤中显著升高（>7）。更重要的是，相关性分析揭示了前列腺癌样本中PHF8和FOXA2水平之间的正相关性（补充材料，图S6系列H） 热图进一步证实了这一发现（补充材料，图S6系列一） 反映了PHF8和FOXA2水平及其表达与恶性程度的关系。由于NEPC中PHF8和FOXA2的水平较高且相互正相关，因此我们建议PHF8与FOXA2水平升高可以单独或联合作为NEPC的诊断生物标志物。