1. 发育生物学

早期小鼠胚胎胚外和胚胎区中胚层迁移的不同表型

  1. 贝查拉·萨卡利
  2. 纳夫里塔·马蒂亚
  3. 沃利斯·纳哈布
  4. 玛丽·露西·拉库
  5. 拉蒂法·哈姆穆
  6. 马蒂厄·德夫兰斯
  7. 伊莎贝尔·米吉奥特  是通讯作者
  1. 比利时布鲁塞尔自由大学
  2. 比利时瓦隆生命科学和生物技术卓越
https://doi.org/10.7554/eLife.42434
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  1. 贝查拉·萨卡利
  2. 纳夫里塔·马蒂亚
  3. 沃利斯·纳哈布
  4. 玛丽·露西·拉库
  5. 拉蒂法·哈姆穆
  6. 马蒂厄·德夫兰斯
  7. 伊莎贝尔·米吉奥特
(2019)
小鼠早期胚胎胚胎外和胚胎区不同的中胚层迁移表型
电子生活 8：e42434。
https://doi.org/10.7554/eLife.42434
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摘要

在小鼠胚胎原肠胚形成过程中，外胚层细胞在原始条纹处分层，通过上皮-间充质转变形成中胚层和最终内胚层。新生中胚层中膜报告子的镶嵌表达使得能够通过实时成像记录细胞形状和轨迹。离开条纹后，细胞改变了形状，并根据相邻的胚层和胚胎区域，伸出不同大小和丰度的突起。胚胎轨迹曲折但有方向性，而胚外中胚层细胞几乎没有净位移。胚胎和胚外中胚层转录体强调了不同的导向、细胞骨架、粘附和细胞外基质特征。具体而言，中间丝在胚外中胚层中高度表达，而F-actin的实时成像显示，仅在胚胎中胚层有丰富的肌动蛋白丝。因此，罗亚或种族1中胚层的条件缺失抑制胚胎，但不抑制胚外中胚层迁移。总的来说，这表明单独的细胞骨架调控与中胚层亚群的形态和迁移相协调。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.001

eLife摘要

随着胚胎的发育，其细胞分裂并专门形成不同的组织和器官。在发育早期，细胞排列成所谓的胚层，每个胚层产生特定类型的组织。其中一层称为中胚层，发育成胚胎的肌肉、骨骼和循环系统。它也有助于滋养和保护胚胎的支撑结构，如胎盘、脐带和卵黄囊。如果这些“胚外”结构没有正确发育，胚胎可能无法正常生长。

我们对中胚层细胞如何移动以形成不同组织的了解大多来自对产卵物种的研究；例如，小鸡、青蛙和鱼。这些动物胚胎发育的最初步骤与哺乳动物的发育过程相似，但随着胚胎外组织的开始形成，会出现更大的差异。最近的方法学进展使得动态研究活体小鼠胚胎发育的这一后期阶段成为可能。

Saykali等人研究了小鼠胚胎，这些胚胎的中胚层细胞中含有一个“报告细胞”，当使用被称为双光子实时成像的显微镜技术观察时，可以对其进行识别。这种方法可以在细胞穿过活组织时进行追踪。Saykali等人发现，中胚层细胞的形状取决于它们所处的胚胎区域以及紧邻的胚层。成为胚外细胞的细胞更大更长，并形成小突起。他们往往会曲折前行，而不是直接前往目的地。

进一步的实验表明，胚胎和胚外中胚层细胞产生不同数量的几种蛋白质，包括作为细胞内骨架的不同类型的细丝。注定要成为胚外细胞的中胚层细胞很少依赖称为Rho-GTPases的信号蛋白来移动。

了解中胚层细胞如何形成胚胎外结构将有助于研究人员了解这些结构的问题如何影响胚胎的生长。Saykali等人使用的技术也将有助于设计在实验室培养中胚层细胞的新方法，以供未来实验使用。例如，这些可以研究人类中胚层细胞是否与小鼠中胚层的细胞以相同的方式发育。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.002

介绍

在小鼠中，胚胎和胚外谱系的第一次分离始于胚胎第3.5天的胚泡，此时滋养层与内细胞团分开。第二步是将内细胞团分离为外胚层，外胚层是大多数胎儿细胞谱系的前体，也是胚外原始内胚层(Chazaud和Yamanaka，2016年). E6时，胚胎呈杯状，前后轴明确。它由三种细胞类型组成，分为两层：内层由远缘外胚层和近缘胚外外胚层组成；外层，内脏内胚层，覆盖整个胚胎表面。原始条纹是原肠胚形成的部位，形成于胚胎和胚外区域交界处的后外胚层E6.25处，随后延伸至胚胎的远端。原始条纹是胚胎的区域，在那里，外胚层细胞通过上皮-间充质转变分层，生成新的间充质细胞群，形成中胚层和最终的内胚层。

包括胚外中胚层在内的所有中胚层均为胚胎外胚层起源。在原肠胚形成开始时，新兴中胚层要么以所谓的胚胎中胚层翅膀的形式向前迁移，要么以胚胎外中胚层的形式向近处迁移(Arnold和Robertson，2009年;萨瑟兰，2016). 细胞谱系研究表明，中胚层祖细胞在外胚层中的位置与中胚层后代的最终定位之间几乎没有相关性(劳森等人，1991年). 相反，中胚层亚群的分布取决于通过原始条纹细胞募集的时间顺序和前后位置(Kinder等人，1999年). 后原始条纹细胞是胚外中胚层的主要来源，而来自中、前原始条纹的细胞则主要流向胚胎本身。然而，在不同位置和时间分层的细胞之间存在命运重叠(Kinder等人，1999年;Kinder等人，2001年). 胚外中胚层参与羊膜、尿囊、绒毛膜和内脏卵黄囊的形成。它在母婴保护和沟通以及原始红细胞生成中具有重要作用(Watson and Cross，2005年). 胚胎中胚层分为侧板、中胚层、近轴和轴中胚层，最终形成颅骨和心脏间充质、血管和造血祖细胞、泌尿生殖系统、肌肉和骨骼等。内皮前体与中胚层前体在翅膀中共同迁移，并经历间质-上皮转换，嵌入内脏内皮(Viotti等人，2014年).

中胚层迁移机制的研究主要集中在苍蝇、鱼类、青蛙和鸡胚中。在苍蝇原肠胚形成期间，中胚层细胞集体迁移(Bae等人，2012年). 在鱼里底鱂，背胚芽环的深层细胞以松散的簇状移动，轨迹蜿蜒(Trinkaus等人，1992年). 在原肠胚中期，斑马鱼外侧中胚层细胞不伸长，并以个体的形式沿间接路径迁移，而在原肠胎晚期，细胞更极化，其轨迹更直，因此速度更快(Jessen等人，2002年). 在斑马鱼前索板中，所有细胞都具有相似的迁移特性，但它们需要彼此接触才能进行定向迁移(Dumortier等人，2012年). 在小鸡体内，细胞在高密度下以非常定向的方式迁移。尽管细胞经常与邻居们建立或中断联系，但它们仍然保持着紧密的联系(Chuai等人，2012年).

对小鼠中胚层迁移的了解相对较少，因为大多数具有中胚层缺陷的突变表型是由原始条纹形成、中胚层规格或上皮-间质转化的异常引起的(阿诺德和罗伯逊，2009年)阻止了对细胞迁移机制的进一步了解。我们之前确定了Rho GTPase Rac1在中胚层迁移和粘附中的作用，它是细胞骨架重组的介质(Migeotte等人，2011年).

小鼠胚胎培养和活体成像的最新进展克服了在进行高分辨率成像的同时保持适当胚胎生长和形态的挑战。它有助于揭示细胞过程的精确时空调控，并揭示了有时从静态分析中得出的不准确结论(Viotti等人，2014年). 携带细胞核报告器的小鼠胚胎的实时成像表明，中胚层翅膀中的个体迁移而非集体迁移(Ichikawa等人，2013年). 最近，一种引人注目的自适应光片成像方法允许在单细胞水平重建从原肠胚形成到早期器官发生的命运图(McDole等人，2018年). 然而，关于中胚层种群如何在穿越不同的胚胎区域以实现各自的命运时调节其形状和迁移机制，我们知之甚少。

在这里，表达膜结合GFP的新生中胚层的高分辨率实时成像被用来定义中胚层细胞形态及其轨迹的动力学。中胚层细胞表现出多种细胞形状变化，这取决于它们在胚胎中的空间定位以及它们所接触的胚层。胚胎中胚层的迁移路径是曲折但有方向性的，并且依赖于Rho-GTPases Rhoa和Rac1。值得注意的是，胚外中胚层运动是GTP酶独立的。不同中胚层种群的转录组揭示了特定的导向、粘附、细胞骨架和基质成分，这可能是中胚层亚型之间细胞行为显著差异的基础。

结果

胚胎与胚外区域的中胚层迁移模式和细胞形状不同

T盒转录因子Brachyury公司在形成原始条纹的后外胚层细胞中表达，维持在通过条纹分层的细胞中，一旦细胞在中胚层翅膀中向前生长，则表达下调(威尔金森等人，1990年). 为了可视化新生中胚层，Brachyury公司-Cre（以下简称T型-Cre）转基因动物，其中编码Cre cDNA的构建物与Brachyury公司随机插入原始条纹中的基因导向基因表达(Feller等人，2008年;Stott等人，1993年)，杂交到膜报告系：Rosa26:：membrane dtTomato/membrane GFP(Muzumdar等人，2007年)（简称mTmG）(图1). 在T型-Cre；mTmG胚胎、原始条纹和中胚层衍生细胞具有绿色膜（mG），而所有其他细胞具有红色膜（mT）。在E6.75或E7.25解剖的胚胎根据唐斯和戴维斯（1993）(图1-图补充1a)并通过共焦或双光子激发实时成像在不同方向进行8至12小时的检查(图1，图1——补充图1c和d，视频1和2). mT到mG的转换最初是在早/中期条纹（E/MS）阶段观察到的，最初是镶嵌的，这有助于以高细胞形状分辨率追踪单个迁移细胞。从中/晚条纹（M/LS）开始，大多数原始条纹细胞经历了从红色到绿色的转换(图1——补充图1e、f).

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新生中胚层的镶嵌膜GFP标记允许通过胚胎活体成像跟踪单个细胞的迁移。

(一)后视图。上图：3D方案，中胚层为绿色，其余胚胎为灰色。虚线分隔胚胎和胚外区域。中间：双光子堆栈的Z投影。底部：高亮显示原始条纹的光学切片。(b条)侧视图，左前方。顶部：2D方案。中间：双光子堆栈的Z投影，显示细胞从后向前进展。底部：矢状光学切片。(c（c）)前视图。顶部：3D方案。中间：双光子叠加的Z投影，大多数前细胞到达中线。底部：光学切片放大到向中线延伸的丝状体上。所有胚胎在E7.25时解剖，处于晚条纹/早芽阶段。VE：内脏内胚层；mG：膜GFP，绿色；mT：膜dt番茄，灰色；EB：早期预算；LS：晚连胜；0B：零预算。（比例尺：50μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.003
视频1
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中胚层细胞向胚外和胚胎区域迁移。

共焦叠加的Z投影T型-Cre；mTmG胚胎于E6.75（早期条纹期）解剖并成像320分钟。中胚层细胞表达膜GFP（绿色）；所有其他细胞都表达膜dtTomato（红色）。前斜向，后向右（比例尺：50μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.006
视频2
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“试错”轨迹。

共焦叠加的Z投影T型-Cre；mTmG胚胎在E6.75（条纹中期）解剖并成像260分钟。中胚层细胞表达膜GFP（绿色）；所有其他细胞都表达膜dtTomato（红色）。前部倾斜方向，后部向右（标尺：50μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.007
视频3
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跟踪中胚层迁移。

共聚焦堆栈的3D快照T型-Cre；mTmG胚胎在E6.75（早期条纹阶段）解剖并成像180分钟，在整个时间间隔内跟踪手动高亮显示的细胞。视频首先显示突出显示的细胞，然后以循环方式显示原始图像（绿色的GFP膜）以进行比较。所有其他细胞都表达膜dtTomato（灰色）。侧向，左前方（标尺：50μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.008
视频4
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追踪中胚层的迁移。

共聚焦堆栈的3D快照T型-Cre；mTmG胚胎在E6.75（早期条纹阶段）解剖并成像160分钟，在整个时间间隔内跟踪手动高亮显示的细胞。视频首先显示突出显示的细胞，然后以循环方式显示原始图像（绿色的GFP膜）以进行比较。所有其他细胞都表达膜dtTomato（灰色）。侧向，左前方（标尺：50μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.009

通过胚胎成像，从胚胎发育的ES和早期芽（EB）阶段的不同角度记录中胚层细胞的形状及其轨迹，以获得每个胚胎区域的最佳质量图像(图1和视频1和2). 后视图(图1a)如前所述，显示出近端到远端原始条纹延伸和离开条纹的瓶形细胞的基底圆形(Williams等人，2012年). 横向视图(图1b)当细胞在中胚层翅膀中横向迁移或在胚胎外区域中近侧迁移时，可以进行比较。前视图(图1c)显示细胞向中线移动。成像时间框架不允许跟踪单个细胞从原始条纹的出口到最终目的地。然而，我们获得的轨迹(视频3和4)配有使用细胞标记或移植构建的命运图(Kinder等人，1999年;Kinder等人，2001年)，或自适应光片显微镜(McDole等人，2018年). 在E6.75左右解剖的ES胚胎中的第一个转化（GFP阳性）细胞通常离开原始条纹的后部，向胚外室迁移。胚胎迁移几乎同时开始，向这两个地区的迁移持续进行。

引人注目的是，迁移行为(图2a，视频3和4)和单元格形状(图2b)细胞迁移到的区域不同。在胚胎区域，中胚层细胞有一个整体的前后路径，尽管它们在各个方向（近端、左右、甚至前后）都呈之字形。细胞不连续迁移，但表现出翻滚行为与更直位移的交替，如斑马鱼肠系膜祖细胞所述(Diz-Muñoz等人，2016年). 来自ES/MS胚胎的胚胎中胚层细胞被追踪2.5小时，以0.65µm/min的平均速度移动，覆盖大约90µm，移动净距离为40µm(图2a'，表1). 直线度（净位移与行程位移之比，因此值1代表线性路径）约为0.5(图2a'，表1). 胚胎外区域的细胞移动速度稍慢（0.45µm/min），达到约70µm，但它们的净位移（20µm）和直线度（0.3）明显较小，反映出没有明显方向性的轨迹(图2a'，表1、和视频5).

表1
跟踪胚胎和胚外中胚层的详细信息。

追踪细胞约150分钟。使用Mann–Whitney–Wilcoxon计算P值。数据可以在中找到图2-源数据1.

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.010
净位移（μm）行程位移（μm）直线度平均速度（μm/min）
平均值扫描电镜平均值扫描电镜平均值扫描电镜平均值扫描电镜N个
胚外的20.583.7467.506.010.310.040.440.0317
胚胎期的42.642.7991.863.510.480.030.670.0334
P值7.93至055.29E-01号1.54E-03型1.99E-05
图2
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胚胎和胚外中胚层种群具有不同的形态和迁移模式。

(一)共焦叠加的Z投影T型-cre；mTmG胚胎于E6.75（早期条纹）解剖，细胞迁移追踪120分钟。左前方。白线标记胚胎/胚外边界。（比例尺：50μm）。(a’)胚胎（黑色，4个早/中期条纹胚胎中的n=34）和胚外（灰色，n=17个细胞）中胚层细胞的行程和净位移（左侧）以及路径直线度（右侧，0到1）的量化（平均值±SEM）。数据可以在中找到表1和图2-源数据1. (b条)胚胎和胚外中胚层细胞形状（从4个晚条纹胚胎中提取的图像）（双光子堆栈的Z投影，比例尺：10μm）。(b’)左图：2D内椭圆的长轴/短轴比，作为细胞拉伸的定量（平均值±SEM，n=85个黑色胚胎细胞，n=83个灰色胚胎外细胞，8个中条纹至零芽期胚胎）。右：定量（平均值±SEM）胚胎（黑色，5个中条纹至早芽期胚胎中的167个细胞）和胚外（灰色，n=28个细胞）中胚层细胞中每个时间点每个细胞的丝状体数量。数据可以在中找到表2，图2-源数据2和三使用Mann–Whitney–Wilcoxon计算P值。mG：膜GFP，绿色；mT：膜dt番茄，灰色。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.011
图2-源数据1

胚胎和胚外中胚层细胞追踪：详细列出单个细胞追踪、体积和表面测量结果。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.012
图2-源数据2

胚胎和胚外中胚层形状测量。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.013
图2-源数据3

胚胎和胚外中胚层细胞丝状体：丝状体数量/细胞/时间点和丝状体长度测量。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.014
视频5
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胚外中胚层迁移的特点是净位移低。

共焦叠加的Z投影T型-Cre；mTmG胚胎在E6.75（早期条纹阶段）解剖，并进行860分钟的图像处理，以显示胚外中胚层细胞。中胚层细胞表达膜GFP（绿色）（比例尺：10μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.015

胚外细胞的体积是原来的两倍大，而且更长(图2b，b'，表2). 尺寸的增加可归因于较低的除法频率(图1——补充图1b). 它们很少有大的突起，丝状伪足稀少而短(图2b，b'，表2).

表2
胚胎和胚外中胚层细胞形状、大小和丝状体的比较。

使用Mann–Whitney–Wilcoxon计算表面、长轴/短轴和丝足/细胞/时间点的P值，以及体积和丝足长度的t检验。数据可在中找到图2-源数据2和三.

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.016
体积（μm三)表面（μm2)长/短轴丝状体/细胞丝状体长度（μm）
平均值扫描电镜平均值扫描电镜平均值扫描电镜N个平均值扫描电镜平均值扫描电镜N个
胚外的4253.03234.802438.82105.592.170.09833.070.326.200.3728
胚胎期的2002.0881.361308.6339.141.660.05856.860.2180.14167
P值2.10E-16号机组2019年5月41日3.04至053.28E-11号机组5.24E-04号

中胚层细胞根据与不同胚层的相互作用而具有不同的形态

据报道，通过原始条纹的细胞是(Ramkumar等人，2016年;Williams等人，2012年)，瓶形，底部为圆形细胞体，顶部为薄突起(图3a). 与外胚层和内脏内胚层接触的中胚层细胞向各自的基底膜发出薄突起(图3b，b'、和视频6). 有趣的是，在与内脏内胚层接触的细胞中，薄突起的密度要高得多。由于早在后区ES就观察到这种表型，它可以反映出近端后内脏内胚层的假定信号作用，该内胚层在原肠胚形成过程中保持一致(Kwon等人，2008年). 从LS期开始，在内脏内胚层插入预期的最终内胚层细胞(Viotti等人，2014年)很少观察到，也因为Brachyury没有标记内胚层祖细胞(伯彻尔和利克特，2009年)，或者因为T型-Cre转基因株在预期内胚层中不携带驱动T表达的调控元件。翅膀中被其他中胚层细胞包围的紧密簇状细胞的轮廓更平滑，但需要注意的是，类似膜色的细胞之间无法看到突起。重组不完全的翅膀前部的细胞重建显示中胚层细胞之间有薄突起(图1c). 细胞也延伸出长而宽的突起，跨越数个细胞直径，在细胞体移位之前向多个方向发送，这似乎是一个反复试验的过程(图3c和视频1，2和7). 无法评估潜在领导细胞的存在，因为第一个转变为绿色的细胞不是最前面的细胞(图1——补充图1e). 尽管如此，始终观察到具有扫描行为的细胞，这表明所有细胞都能够探索其周围环境。

图3
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迁移中胚层的细胞形状变化。

(一)在中条纹胚胎的原始条纹处新生中胚层分层的细胞形状进展（双光子堆叠的Z投影，比例尺：10μm）。(b条)中胚层细胞向外胚层和内脏内胚层延伸丝状伪足（箭头）。胚胎处于晚条纹阶段。（双光子堆栈的Z投影，比例尺：10μm）。(b’)每个时间点每个细胞的丝状体定量为平均值±SEM，n=40个细胞，每个胚胎为4个晚条纹胚胎，p<0.0001。采用t检验计算P值。数据可以在中找到图3-源数据1. (c（c）)中胚层细胞（来自条纹中期胚胎）的蒙太奇，显示寻找行为（双光子堆栈的Z投影，比例尺：10μm）。(d日)通过手动分割，中胚层细胞以红色、蓝色和黄色突出显示，以跟踪分裂后的细胞行为（条纹中期胚胎共焦叠加的Z投影，前视图，比例尺：50μm）。mG：膜GFP，绿色；mT：膜dt番茄，灰色。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.017
图3-源数据1

中胚层细胞丝状体向内胚层和外胚层延伸。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.018
图3-源数据2

子细胞轨迹的量化。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.019
图3-源数据3

近距离细胞轨迹的量化。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.020
图3-来源数据4

碰撞后细胞轨迹的量化。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.021
视频6
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中胚层向外胚层和内脏内胚层延伸丝状伪足。

双光子堆栈T型-Cre；mTmG胚胎处于晚条纹期。堆叠从前面到后面进行。中胚层细胞表达膜GFP（绿色）；所有其他细胞表达膜dtTomato（灰色）（比例尺：50μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.022
视频7
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搜索行为。

双光子堆栈的Z投影T型-Cre；对处于条纹中期的mTmG胚胎成像100分钟。箭头指向胚胎中胚层细胞。中胚层细胞表达膜GFP（绿色）；所有其他细胞都表达膜dtTomato（灰色）（比例尺：50μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.023

细胞间接触对中胚层内轨迹的影响

为了解决中胚层迁移的聚集性，我们通过比较有丝分裂后子细胞的轨迹、观察开始时紧邻的不相关细胞对以及沿途细胞碰撞来评估细胞邻近性对行为的影响。

正如命运映射实验所预期的那样，中胚层内有丝分裂产生的子细胞遵循紧密平行的轨迹(图3d和图3-源数据2). 在204分钟内，它们以相同的方向（角度：7±1.13°）移动了相似的净距离（净位移比：0.91±0.01，n=12对来自E/MS阶段的四个胚胎），其中一个子细胞显示出较高的直线度（移动位移比：0.61±0.07）。它们彼此保持接近（子细胞之间的平均距离：15.6±2.35µm），但没有直接并置。有趣的是，即使被其他细胞隔开，它们也会被薄薄的突起连接数小时(图3d).

在时间零点紧邻的细胞对在152分钟内以相同方向（角度：9.9°±2.77）移动了相似的距离（净位移比：0.88±0.03，n=13对来自四个胚胎）；它们保持接近（行程位移比和最终距离分别为0.75±0.04和15.2µm±3.84µm）(图3-源数据3). 大多数成对细胞突起之间可以看到接触。

中胚层细胞迁移通常与神经嵴迁移相比较，因为这两种细胞类型都是通过上皮-间充质转化产生的(罗伊克罗夫特和市长，2016年). 神经嵴迁移的一个重要特征是接触抑制运动，碰撞的细胞倾向于朝相反的方向移动。相反，大多数中胚层细胞在碰撞时保持接触(图3-源数据4)：从5个胚胎干细胞到零芽（0B）胚胎的24个细胞对中，有16个保持附着2.5小时（其中一个在重新接合前短暂失去接触），3/24保持接合约1小时，5/24对立即分离。我们分割了8对，持续166分钟，在追踪结束时观察到平均距离为52.5±32.5µm；它们遵循平行轨迹（角度：8.25±1.7°，n=8对），具有相似的净距离（净位移比：0.85±0.07；行程位移比：0.64±0.11）。接触后，偶尔可以在它们之间观察到薄突起。

这些数据表明，接近的细胞往往有类似的行为。它们之间的薄突起可能反映了细胞间的通信。

胚胎和胚外中胚层分子特征

通过荧光（GFP）辅助细胞分选从E7.5 MS和LS中分离出胚胎和胚外中胚层细胞T型-Cre；mT/mG胚胎以生成转录体。两个阶段的生物复制（4 MS，2 LS）导致根据胚胎区域对样本进行分组(图4a、b). 基于单细胞测序鉴定的胚胎和胚外基因特征的非监督聚类Scialdone等人（2016）显示样品按预期分离（未显示）。我们对在这两个阶段获得的胚胎和胚外样本进行了两两比较，并选择了具有一致差异表达且倍数变化>2的基因。胚胎或胚外中胚层丰富的基因簇的基因本体分析强调了预期的发育（胚胎外的血管生成和造血，胚胎中的体细胞发生）和信号传递（胚胎外、Wnt和Notch中的BMP和VEGF）生物过程(图4——补充图1a，a'). 有趣的是，在涉及迁移、粘附、细胞骨架和细胞外基质组织的基因簇中也发现了差异。

图4带1个补充查看所有内容
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中胚层种群的转录组识别胚胎和胚外中胚层之间的差异。

(一)t-分布随机邻域嵌入（t-SNE）证实了E7（条纹中期）和E7.25（条纹晚期）相似生物样本的分组。EM：胚胎中胚层；EEM：胚外中胚层。有关更多示例信息，请参阅图4-来源数据1. (b条)热图显示胚胎和胚外中胚层之间差异表达的基因，具有最高的统计意义。(c、 e（电子）)胚胎中高表达基因的筛选(c（c）)或胚胎外的(e（电子）)中胚层，表示为E7时log2 fpkm的平均值±SEM（n=4个生物复制，p<0.01），胚胎为黑色，胚外为灰色。所有代表的基因也在E7.25显著差异调节。数据可以在中找到图4——源数据2和三. (d日)零胚至早芽期胚胎矢状切面（左前方）的原位杂交，突出了Epha4号机组，Efa1公司，埃夫纳1和Efna3号机组以红色圆点表示，位于后部。整个胚胎切片如所示图4——补充图1.（比例尺：100μm）(（f）)早蕾期胚胎的矢状面（左前方）染色，检测血小板内皮细胞粘附分子1（左面板，Pecam-1为绿色，共焦叠加的Z投影）、波多卡利新（右面板，Podxl为绿色，光学切片）和F-actin（磷脂，灰色）。mGFP染色见同一节图4——补充图1白线标记胚胎/胚外边界。（比例尺：50μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.024
图4——源数据1

用于RNA-seq的样品的描述和质量控制。

EM：胚胎中胚层；EEM：胚外中胚层。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.026
图4——源数据2

表达式级别。

包含使用rpkm-edgeR方法计算的log2 FPKM中的表达式级别的表。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.027
图4——源数据3

差分表达式的排名列表。

第1列：基因名称，第2列：log2 EM_E7.0和EEM_E7.0之间的折叠变化，第3列：log2EM_E7.25和EEM_E7.25之间的折叠改变，第4列：每百万次计数，第5列：F-test值，第6列：F-test值，第7列：F-stest FDR（Benjamini-Hochberg）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.028

在富含胚胎中胚层的原肠胚中发现具有已知表达模式的基因，包括明确的转录因子以及FGF、Wnt、Notch、TGFβ和维甲酸途径效应器(图4——补充图1b). 预计在胚胎外中胚层中更多表达的基因包括转录因子等1和Tbx20塔布和TGFβ途径的几个成员(英曼和唐斯出版社，2007年;Pereira等人，2011年) (图4-图补充1c). 原始造血是产生原始红细胞、巨噬细胞和巨核细胞的血细胞生成的初始波，发生在血岛的血源性成血管细胞E7.25左右(拉科德和库斯科夫，2017年). 从MS到LS，血管母细胞发育、内皮分化和造血相关基因的表达增加(图4f和图4-图补充1c). 此外，我们确认了通过E7.5的消减杂交鉴定的两个胚外基因(Kingsley等人，2001年):阿纳克(图4-图补充1c)，另请参见Downs等人（2002年）和印记基因H19型(图4-图补充1c).

在胚胎中胚层中高表达的基因中，特别令人感兴趣的是与基质相关的基因，这些基因在发育阶段没有表达数据(Lama1、Galnt16、Egflam)，附着力(Itga1、Itga8、Pcdh8、Pcd h19、Pmaip1)、和指导(Efa1公司和4，机器人3，塞马6d，Ntn1) (图4c).Epha4号机组小鼠胚胎在神经板（NP）阶段的躯干中胚层和发育中的后脑中的表达(Nieto等人，1992年). 在LS胚胎中，Epha4号机组在原始条纹和胚胎中胚层中表达较高(图4d和图4——补充图1e). 动态Epha1、Efna1和Efna3原肠胚形成期间出现了表达模式(Duffy等人，2006年). 在LS/0B胚胎中，Efa1公司mRNA存在于原始条纹中，主要位于其远端。它的配体埃夫纳1呈逆梯度的原始条纹，主要表达于胚外区，尤其在羊膜和绒毛膜中。Efna3号机组绒毛膜中含量丰富(图4d和图4——补充图1e).

同时，在胚外中胚层中，我们发现不同组基因的高表达具有潜在的指导作用(Unc5c、Dlk1、Scube2、Fzd4)，矩阵构成(Hapln1、Col1a1、Lama4)，附着力(Itga3、Pkp2、Podxl、Ahnak、Adgra2、Pard6b)，Rho GTPase调节(Rhoj，标准8，Rasip1)和细胞骨架(Myo1c、Vim，Krt8（Krt8）和Krt18）(图4e和未显示）。有趣的是，波多卡莱辛(Podxl）大量存在于胚胎外中胚层(图4f和图4：补充图1d)与胚胎和类胚体单细胞测序数据相吻合Podxl公司是早期胚外中胚层和卵黄囊原始红系祖细胞的标记(Zhang等人，2014).

胚胎和胚外中胚层细胞具有不同的细胞骨架组成

鉴于细胞形状和迁移的差异，我们将重点放在细胞骨架，特别是肌动蛋白和中间丝蛋白（波形蛋白和角质蛋白）上。正如预期的那样，在所有中胚层细胞中都发现了波形蛋白，但在胚外中胚层中更为丰富(图5a). 值得注意的是，在中胚层内，角蛋白8在胚胎外中胚层细胞（羊膜皱褶、羊膜、绒毛膜和发育中的尿囊）中选择性表达(图5b–d). 相反，通过Phalloidin染色观察到的丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）网络在胚胎中胚层中似乎更密集(图5a). 为了仅在中胚层中显示F-actin，我们利用了一种表达Lifeact-GFP的条件小鼠模型，Lifeact-GFP是一种与F-actin特异性结合的低亲和力肽，因此报告了肌动蛋白的动力学而没有破坏它们(Schachtner等人，2012年). 的实时成像T型-Cre；MS和LS期的LifeAct-GFP胚胎证实，虽然在胚胎中胚层细胞中可以清楚地看到LifeAct-GFP阳性丝，但GFP在胚外中胚层中较弱且弥散(图5e和视频8).

图5
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胚胎和胚外中胚层细胞具有不同的细胞骨架组成。

(一)早期芽期胚胎矢状切面共焦叠加的Z投影，波形蛋白、F-肌动蛋白和细胞核（DAPI）染色。(b、 d日)Late Streak矢状截面共焦叠加的Z投影(b条)角蛋白8（灰色）和细胞核（DAPI，蓝色）染色的早期胚胎（c:20x，d:40x）。(e（电子）)整体双光子堆的Z投影T型-Cre；LifeAct-GFP（绿色）晚条纹胚胎。前部在左侧。（比例尺：50μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.029
视频8
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LifeAct-GFP在胚胎中胚层表达较高。

双光子堆栈的3D快照T型-Cre；LifeAct-GFP胚胎在E7.25（晚条纹期）解剖并成像295分钟。图像采用ZEN蓝色去噪功能进行处理。LifeAct-GFP（绿色）突出显示F-actin。右侧胚胎外细胞中的明亮斑点是碎片。侧向，左前方（3D比例尺：50μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.030
视频9
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中胚层外植体。

中胚层外植体共焦叠加的Z投影T型-Cre；mTmG胚胎在E7.5（晚条纹期）解剖。每隔15分钟对外植体成像750分钟。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.031
视频10
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罗亚Δ中胚层电子xplant在细胞迁移之前经历了压实。

中胚层外植体共焦叠加的Z投影T型-Cre；mTmG； 罗亚在E7.5（晚条纹期）解剖fl/-胚胎。每隔15分钟对外植体成像750分钟。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.032

胚外中胚层迁移与Rho GTPases无关

Rho GTPases是一种分子开关，将信号从细胞表面受体传递到细胞内效应器，导致细胞行为的改变(Hodge和Ridley，2016年). 它们是细胞骨架重排的主要调节器(霍尔，1998年)Rho GTPases活性的时空精细调控决定了亚细胞水平的细胞骨架动力学(斯皮林和霍奇森，2011年). 因此，特定Rho GTPase的失活可能会导致不同的后果，这取决于细胞类型和环境。我们之前确定Sox2系统-Cre介导的删除种族1在原肠胚形成开始前的外胚层中，胚胎中胚层的迁移受损，而胚外中胚层迁移受影响较小(Migeotte等人，2011年). 因此，我们假设Rho GTP酶可能在侵袭这两个区域的细胞中受到不同的调节，从而导致细胞骨架动力学、细胞形状和位移模式的一些观察到的差异。

通过杂交杂合野生型/空基因在传递原始条纹的细胞中诱导突变罗亚(Jackson等人，2011年)或种族1(Walmsley等人，2003年)携带T型-带有携带mTmG报告基因的条件等位基因的动物纯合Cre转基因（突变胚胎被称为罗亚Δ中胚层和Rac1Δ中胚层).的表型罗亚Δ中胚层和Rac1Δ中胚层胚胎比罗亚Δepi和Rac1Δepi胚胎（我们未公布的数据和Migeotte等人，2011年) (图6——图补充1). 突变体在E7.5时在形态学上无法区分。在E8.5，罗亚Δ中胚层尽管胚胎外显率不完全，但仍被鉴定为略小于其野生型同卵双胞胎（11/12个突变体具有微妙的表型，其中5个体节数量减少，6个心脏形态异常）(图6——图补充1a). 通过E9.5，所有罗亚Δ中胚层胚胎具有明显的表型（12/12个突变株有一个小心脏，9/12个体节数目减少，2/12个有一个开放的神经管，2/12有一个非融合的尿囊）(图6——补充图1b).种族1Δ中胚层胚胎在E8.5时也有微妙的表型（15/16个胚胎比野生型同窝卵稍小，4/16个胚胎有一个小心脏）(图6——补充图1d). 原位杂交Brachyury公司在5/10个突变胚胎的尾部区域显示较弱的染色，表明胚乳前中胚层减少(图6——图补遗1c). 到E9.5时，所有突变体都有异常的心脏形态和缩短的身长，9个胚胎中有3个严重延迟发育(图6——补充图1e). E10.5时，外显率完全；7／7胚胎有短的畸形体和心包水肿（未显示）。早期的表型变异可能反映了T型-Cre介导的重组。

图6含2种补充剂查看所有内容
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罗亚和种族1中胚层特异性突变体显示胚胎中胚层迁移受损。

(一)Z投影和(b条)野生型正面光学切片（WT）和罗亚Δ中胚层胚胎。虚线标记外胚层。(c（c）)Z投影和(d日)野生型和种族1Δ中胚层胚胎突出了原始条纹附近中胚层细胞的积累（*）。虚线标记外胚层。(e（电子）)野生型和罗亚Δ中胚层胚胎（斜视前视图，右后，双光子）显示胚胎中胚层迁移受损，但胚胎外区域没有。(（f）)野生型和种族1Δ中胚层胚胎（前视图，共聚焦）显示胚胎中胚层迁移受损，而非胚外区域。每一个突变体都与一个方向相似的野生型同卵双胞胎进行比较。白线标记胚胎/胚外边界。mG：膜GFP，绿色；mT：膜dt番茄，灰色。（比例尺：50μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.033

E7.5 MS/LS mTmG胚胎中胚层外植体；Rac1型Δ中胚层或罗亚Δ中胚层胚胎被涂上纤维粘连蛋白。在野生型外植体中，细胞从外植体向外放射状生长，在迁移方向上显示出巨大的跛足(视频9). 在细胞间接触后，它们通过细长的丝状物保持连接。罗亚缺乏的外植体显示单个细胞释放较少(图6——图补充2a).罗亚突变细胞比野生型细胞更具凝聚力，更圆(图6-图补充2c). 值得注意的是，来自罗亚突变胚胎在细胞迁移之前表现出一个致密期(视频10; 2/4罗亚Δ中胚层突变体外植体表现出紧密性）。在种族1外植体(图6——补充图2b)，表达GFP的细胞保留在切除的外植体的区域内，并显示有脓核，而野生型非GFP细胞可以迁移。5个突变外植体中有4个从培养板上脱落，无法进行实时成像。这与来自种族1外胚层特异性突变体(Migeotte等人，2011年)，并归因于缺乏粘附依赖性生存信号。

mTmG的实时成像；罗亚Δ中胚层或Rac1Δ中胚层在E6.75或7.25解剖胚胎(图6)表明大多数罗阿和种族1中胚层特异性突变体（4/8用于罗亚，6/9用于种族1)原始条纹处有细胞聚集，在外胚层和内脏内胚层之间的背面形成一个团块(图6a–d和视频11)表明中胚层迁移缺陷。有趣的是，尽管胚胎中胚层的迁移受到了损害，E7.5只能在前侧看到少数细胞，但胚外中胚层迁移仍得以维持(图6e、f和视频12–15). 胚胎中胚层细胞的速度显著下降，但胚胎外中胚层细胞的速度没有明显下降罗亚和种族1与野生型胚胎相比的突变体(图6——补充图1f). 同样，在因以下原因而删除的胚胎中种族1在外胚层和外胚层衍生细胞中Sox2系统-Cre公司(Hayashi等人，2002年)重组后，GFP阳性的中胚层细胞分散在胚外区域，而胚胎中胚层的细胞局限在原始条纹附近的隆起处(图6——补充图2d). 因此，E8.5卵黄囊中胚层衍生血管结构（Pecam-1）的染色显示突变胚胎和野生胚胎之间没有差异(图6——补充图2e、f). 这些发现表明，胚外中胚层细胞要么不依赖Rac1和Rhoa进行运动，要么能够补偿种族1或罗亚这与它们缺乏富含肌动蛋白的突起一致。

视频11
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罗阿Δ中胚层胚胎在原始条纹附近有中胚层积累。

双光子Z堆栈T型-Cre；mTmG；罗亚fl/-胚胎处于晚条纹期。中胚层细胞表达膜GFP（绿色）；所有其他细胞都表达dtTomato膜（灰色）。左前方倾斜定位（标尺：50μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.039
视频12
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中胚层迁移跟踪罗亚Δ中胚层胚胎。

堆栈的三维快照T型-Cre；mTmG；罗亚fl/-胚胎在E7.25（条纹中期阶段）解剖，并使用双光子显微镜进行120分钟成像，显示高亮细胞，这些细胞在整个时间推移过程中进行跟踪。视频首先显示高亮显示的细胞，然后以循环方式显示原始图像（绿色的膜GFP）以进行比较。所有其他细胞都表达膜dtTomato（灰色）。左前方倾斜定位（标尺：50μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.040
视频13
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中胚层迁徙追踪罗亚Δ中胚层胚胎。

堆栈的三维快照T型-Cre；mTmG； 罗亚fl/-胚胎在E7.25（条纹中期）解剖，并使用双光子显微镜进行100分钟成像，显示高亮细胞，在整个时间过程中进行跟踪。视频首先显示高亮显示的细胞，然后以循环方式显示原始图像（绿色的膜GFP）以进行比较。所有其他细胞都表达膜dtTomato（灰色）。左前方倾斜定位（标尺：50μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.041
视频14
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中胚层迁移跟踪种族1Δ中胚层胚胎。

双光子堆栈的3D快照T型-Cre；mTmG；种族1fl/-胚胎在E7.25（条纹中期）解剖并成像80分钟，显示高亮的细胞，这些细胞在整个时间过程中都会被追踪。视频首先显示高亮显示的细胞，然后以循环方式显示原始图像（绿色的膜GFP）以进行比较。所有其他细胞都表达膜dtTomato（灰色）。侧向，左前方（标尺：50μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.042
视频15
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中胚层迁徙追踪种族1Δ中胚层胚胎。

共聚焦堆栈的3D快照T型-Cre；mTmG； 种族1在E6.75（早期条纹阶段）解剖fl/-胚胎，并拍摄120分钟的图像，显示高亮细胞，这些细胞在整个时间过程中都会被追踪。视频首先显示高亮显示的细胞，然后以循环方式显示原始图像（绿色的膜GFP）以进行比较。所有其他细胞都表达膜dtTomato（红色）。前向（比例尺：50μm）。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.043

讨论

中胚层细胞从外胚层剥离需要基底膜破裂、顶端收缩、顶端基底极性丧失、细胞间粘附改变和运动能力的获得(Nieto等人，2016年). 参与上皮-间充质转化的转录网络和信号通路是保守的(拉姆库马和安德森，2011年). 然而，原肠胚形成前胚胎的几何形状在物种之间差异很大，这对胚层之间的相互作用和新生中胚层细胞的机械约束具有重要影响(Williams和Solnica-Krezel，2017年). 小鼠胚胎的实时成像允许记录后外胚层重排，以及细胞通过原始条纹的过程(Ramkumar等人，2016年;Williams等人，2012年). 与鸡胚相反，在小鼠中没有向原始条纹方向的整体外胚层运动。然而，细胞的形状变化，包括顶端收缩和基部圆形，是相似的。通过扫描电子显微镜获得的小鼠中胚层细胞的形态学数据(Migeotte等人，2011年)和胚胎切片的透射电子显微镜(施皮格曼和贝内特，1974年)揭示了由丝状伪足连接的星状单个细胞阵列，其中包含微丝晶格。

我们利用新生中胚层的镶嵌标记来定义与中胚层迁移相关的细胞形状变化的动力学。条纹外的细胞收缩长的顶端突起，形成圆形，许多丝状伪足与邻近但也较远的中胚层细胞接触。在中胚层翅中，与内脏内胚层相邻的细胞相比，靠近外胚层的细胞更松散地并置，向其基底膜延伸的丝状伪足更少，内脏内胚内胚层的相邻细胞紧密排列，并显示出许多指向内脏内胚层基底膜的丝状假足。

细胞从后向前向中线移动时，显示出较长的突起，最大为细胞体大小的两倍，在细胞体自身开始移动之前，突起延伸、收缩，偶尔分叉数次，表明细胞具有探索行为。值得注意的是，长突起的延伸并不局限于第一排细胞。迁移在时间和空间上都是不规则的，因为细胞经常停下来翻滚，并显示出奇怪的轨迹。分裂后，细胞仍由薄突起附着。与神经嵴细胞相反，中胚层细胞没有表现出运动接触抑制。紧邻的细胞往往遵循平行的路径。

胚外中胚层首先聚集在胚胎后侧的胚外外胚层和内脏内胚层之间，形成羊膜绒毛膜皱褶，隆起进入羊膜前腔(Pereira等人，2011年). 这个褶皱扩张，横向延伸在中线处汇合。皱襞的胚外中胚层细胞之间的腔隙积聚和合并产生了一个由羊膜远侧封闭、由绒毛膜近侧封闭的大腔。在LS期，胚外中胚层形成尿囊芽，尿囊芽是脐带的前身，与原始条纹相连续(英曼和唐斯出版社，2007年). 胚外中胚层细胞与胚胎中胚层相比，在形态和迁移方式上有显著差异。它们更大更细长，丝状伪足更少，几乎没有大的突起。它们以相似的速度迁移，但以更加曲折的方式迁移，导致几乎没有净位移。

方向线索可能来自细胞-基质接触、同型或异型（有外胚层或内脏内胚层）细胞-细胞相互作用、形态因子的扩散梯度和/或机械约束。转录组数据与导向分子（如Netrin1和Eph受体）在指导中胚层迁移中的作用相一致。Epha4号机组在PS和中胚层中强烈表达，特别是在胚胎区域。在爪蟾中胚层Epha4和外胚层Efnb3的相互作用可以在原肠胚形成期间分离胚层(Rohani等人，2014年).Efa1公司及其配体埃夫纳1和三原肠胚形成期间有部分重叠，但基本上是相互分隔的表达模式(Duffy等人，2006年). 此外，我们发现Efa1公司E8.5在体节和节前中胚层中表达（未显示）。有趣的是，Efa1公司KO小鼠呈现扭结的尾巴(Duffy等人，2008年). 特定的动态表达模式Epha4号机组，Efa1公司，它们各自的配体在原肠胚形成期间与胚层分离的作用兼容，包括新生中胚层的分化和迁移。识别这些潜在的指导线索将有助于设计策略，以更好地了解中胚层亚群如何到达各自的目的地。

通过FRET传感器和光激活变体对Rho GTPases活性进行可视化和修改，揭示了它们在体内细胞迁移过程中的基本作用，例如鱼类原始生殖细胞的迁移(Kardash等人，2010年)或果蝇属边界单元格(Wang等人，2010年). 对外胚层特异性突变体的研究表明，Rac1作用于WAVE复合体的上游，促进肌动蛋白丝的分支、跛足足的形成和新生中胚层的迁移(Migeotte等人，2011年). 值得注意的是，胚外中胚层细胞没有显示前缘突起，并且种族1和罗亚中胚层特异性突变体缺乏胚胎，但不缺乏胚胎外中胚层迁移。有趣的是，在胚胎中Fgfr1级(Yamaguchi等人，1994年)或Fgf8型(Sun等人，1999年)，胚外中胚层种群基本正常，而胚胎中胚层衍生物受到严重影响。测量这些突变体中的Rho-GTPase活性将有助于探索Rac1和Rhoa作用于FGF通路下游促进中胚层迁移的可能性，如果蝇属(van Impel等人，2009年).

此外，与胚外中胚层相比，胚胎中的F-肌动蛋白丝更为丰富，这强化了一个假设，即它们可能依赖于不同的细胞骨架重排。中间丝是细胞硬度、细胞基质和细胞间粘附以及个体和集体迁移的主要效应器(Pan等人，2013年). I型和II型角蛋白家族成员形成专性异二聚体，组装成丝状(Loschke等人，2015年). II型角蛋白7和8以及I型角蛋白18和19是胚胎发生过程中首先表达的。角蛋白8/19和18/19联合缺失导致E10处死亡，这归因于巨大滋养层细胞的脆弱性(黑塞等人，2000年). 从E8.5开始，删除整个II型角蛋白簇会导致生长迟缓(Vijayaraj等人，2009年). 最近，青蛙肠系膜角蛋白8的敲除突显了中间丝在协调集体迁移细胞中的作用。角质素缺乏的细胞收缩性更强，表现出方向错误的突起和较大的局灶性粘连，并产生较高的牵拉应力(Sonavane等人，2017年). 成绩单角蛋白8和18，以及波形蛋白，与胚胎中胚层相比，在胚外富集。虽然波形蛋白存在于所有中胚层，但角蛋白8仅在胚外中胚层中检测到。已经描述了波形蛋白中间丝与Rac1介导的跛足病形成之间的拮抗关系(Helfand等人，2011年)Rac1活性和角蛋白中间丝之间可能存在类似的对立(韦伯等人，2012年). 胚外中胚层细胞形态细长，无足类细胞稀少，缺乏定向迁移，这可能是由于中间丝含量高，Rho GTPase活性低所致(图7). 中间丝用K8-YFP报告小鼠株的最新进展(Schwarz等人，2015年)以及可靠的Rho-GTPases FRET传感器的可用性(斯皮林和霍奇森，2011年)，将有助于剖析它们在中胚层中的关系。

图7
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在小鼠胚胎原肠胚形成期间，胚胎和胚外中胚层细胞显示出不同的形状、轨迹、Rho-GTP酶依赖性和细胞骨架组成。

在胚外区域（顶部），中胚层细胞伸展，角蛋白8和波形蛋白丰度较高。它们的位移是复杂的，不依赖于Rho-GTP酶。在胚胎区（底部），中胚层细胞紧密，有许多丝状伪足，并具有较高的F-肌动蛋白丰度。细胞有更直的轨迹，需要Rho GTPases。胚胎方案代表一个左前方的矢状切面。绿色和灰色分别标记中胚层和其他层。

https://doi.org/10.7554/eLife.42434.044

中胚层胚层具有侵袭胚胎和胚胎外部分的特殊性，其迁移对胎儿形态发生和包括胎盘在内的胚胎外组织的发育都很重要。我们发现，胚胎和胚外中胚层种群均由原始条纹处的上皮-间充质转变产生，表现出不同的形状动力学、迁移模式、Rho-GTPase依赖性、细胞骨架组成以及不同导向、粘附和基质分子的表达。20世纪90年代的地标实验表明，中胚层细胞的命运取决于它从原始条纹中浮现出来的时间和地点。我们通过全胚胎活体成像揭示了中胚层种群的形态和行为特异性，并提供了一个分子框架来理解具有不同命运的细胞如何适应并可能修改其三维环境。

材料和方法

关键资源表
试剂类型
（物种）或
资源		任命来源或参考标识符协议
遗传试剂
(小家鼠)		T型-Cre公司PMID：18708576RRID：MGI:3811072
遗传试剂
(小家鼠)		Sox2系统-Cre公司PMID：12617844;
杰克逊家族
实验室		TJL:008454号
遗传试剂
(小家鼠)		毫微克PMID：17868096;
杰克逊家族
实验室		TJL:007676号
遗传试剂
(小家鼠)		种族1有条件的
突变体		PMID：14564011RRID：MGI:3579087
遗传试剂
(小家鼠)		罗亚有条件的
突变体		PMID：21209320
遗传试剂
（小家鼠）		生命法案-绿色食品PMID：22658956
抗体山羊多克隆
抗Pecam-1		研发系统非洲3628如果1/500
抗体兔多克隆
抗足月桂毒素		EMD密理博ABD27型如果1/200
抗体大鼠单克隆抗体
抗角蛋白8		发展
研究杂交瘤
银行		TROMA-I；
AB_531826型		如果1/100
抗体兔单克隆抗体
抗波形蛋白		abcam公司ab 92547号如果1/200
抗体驴多克隆
抗兔Alexa
福陆488		生活
技术		A21206型如果1/500
抗体山羊多克隆
抗兔Alexa
福陆647		生活
技术		A21244型如果1/500
抗体鸡多克隆
抗鼠Alexa
福陆647		生活
技术		A21472型如果1/500
抗体驴多克隆
反山羊Alexa
福陆647		杰克逊A21447型如果1/500
其他TRITC-磷脂Invitrogen公司A12380型1/200
其他DAPI公司西格玛D9542号1/1000
商业
化验或试剂盒		RNA示波器ACD生物ACD生物：322350

小鼠菌株和基因分型

请求详细协议

这个T型-Cre系取自阿希姆·戈斯勒(Feller等人，2008年)，的种族1Victor Tybulewicz的线路(Walmsley等人，2003年)，的罗亚来自Cord Brakebusch的线路(Jackson等人，2011年)，mTmG(Muzumdar等人，2007年)和Sox2系统-Cre公司(Hayashi等人，2002年)Jackson实验室的线路和Laura Machesky的有条件LifeAct-GFP线路(Schachtner等人，2012年). 小鼠置于CD1背景下。根据欧洲指南，小鼠菌落保存在经认证的动物设施中。实验得到了当地伦理委员会（CEBEA）的批准。

在55°C下用溶解试剂（DirectPCR，Viagen）稀释的1.5%蛋白酶K（Quiagen）过夜消化，然后加热灭活，从耳活检中分离小鼠基因组DNA。

胚胎培养和实时成像

请求详细协议

在补充有10%FBS和1%青霉素-链霉素和L-谷氨酰胺以及15mM HEPES的Dulbecco改良Eagles培养基（DMEM）F-12（Gibco）中解剖胚胎。然后在37°C和5%CO的条件下，在50%DMEM-F12和不含酚红的L-谷氨酰胺、50%大鼠血清（Janvier）中培养它们2在配备C Achroplan 32x/0.85和LD C Apochro 40x/1.1物镜的蔡司LSM 780显微镜下，在单个锥形孔（Ibidi）中悬浮观察胚胎，以限制漂移。每隔20分钟采集一次堆栈，间隔3μM Z，最长10小时。成像后再培养胚胎6至12小时，以检查其适合性。

抗体

抗体为山羊抗Pecam-1 1:500（R和D系统）；兔抗波多卡利新1:200（EMD Millipore）；大鼠抗角蛋白8 1:100（发育研究杂交瘤库）；兔抗波形蛋白1:200（abcam）。使用1.5 U/ml TRITC-磷脂（Invitrogen）和DAPI（Sigma）观察F-actin和细胞核。次要抗体为抗兔Alexa Fluor 488和647、抗鼠Alexa Fluor 647（均来自Life technologies）和抗羊Alexa Fuor 647Jackson。

胚胎分析

请求详细协议

按照Eggenschwiller和Anderson（2000）为了在切片上进行原位杂交，胚胎在PBS中解剖，并在4°C的4%PFA中固定30分钟。它们在PBS中清洗，直接嵌入OCT（Tissue-Tek），并在7-10微米处冷冻切片。将载玻片在4%PFA的冰上重新装填15分钟。RNA探针取自ACDBio，并根据制造商的说明使用RNAscope 2.5 HD试剂盒-RED（ACDBio）进行杂交。用50%吉尔苏木精对载玻片进行复染。

对于免疫荧光，胚胎在含有4%多聚甲醛（PFA）的PBS中在4°C下固定2小时，在30%蔗糖中冷冻保存，包埋在OCT中，并在7–10微米处冷冻切片。在含有0.5%Triton X-100%和1%热灭活马血清的PBS中进行染色。切片和完整胚胎在蔡司LSM 780显微镜上成像。

外植体培养和分析

请求详细协议

初生中胚层的原代外植体培养如Burdsal等人（1993年）。外植体在补充有10%FBS、1%青霉素-链霉素和L-谷氨酰胺的DMEM F-12中培养24–48小时，培养在带有1.5盖玻璃（MatTek）的纤维连接蛋白（Sigma）涂层玻璃底微孔35 mm培养皿上。染色前，将其固定在含有4%PFA的PBS中30分钟。对于实时成像，让外植体粘附4-6小时，然后每15分钟成像一次，持续12小时。

图像分析

请求详细协议

使用Arivis Vision4D v2.12.3（德国Arivis）处理图像。在每个Z切片和时间点上手动分割胚胎轮廓，然后使用Arivis Vision4D的漂移校正工具进行登记。必要时手动调整胚胎旋转。我们选择了能够成功配准的胚胎，因此胚胎的残留轻微运动远小于细胞位移。同样，我们发现胚胎生长与细胞移位相比微不足道（数据未显示）。然后，通过使用Wacom的Cintiq 13HD突出显示细胞膜，在每个Z切片和时间点上手动分割细胞。

两个单元之间的净位移、路径长度、速度和角度基于Arivis中分段单元的质心坐标，并由自制的Python脚本（PythonSoftware Foundation，https://www.python.org). 为了提取速度行为，我们对路径长度曲线进行插值并进行推导。路径长度随时间的变化是紧密线性的，因此我们提取了速度值的平均值。通过Arivis计算二维内椭圆的表面、体积、长短轴比和直线度。晚期胚胎的2D Z投影用于量化丝状体长度和密度。在Icy上测量丝状体大小和密度(de Chaumont等人，2012年)并使用自制的Python脚本进行分析。

视频是使用StackReg ImageJ插件生成的(Thévenaz等人，1998年).

所有数据均以平均值±SEM表示。根据数据是否具有高斯分布，我们使用曼希尼-威尔科森或t吨-测试。一个第页值<0.05被认为具有统计学意义。

转录组分析

请求详细协议

T型-Cre；从不同的小鼠中收集mTmG胚胎，并将处于适当阶段的胚胎合并。用锋利的镊子手动切割胚胎，将胚胎和胚外部分分开。用2X胰蛋白酶消化胚胎，直接在提取缓冲液中通过流式细胞术（FACSARIA III，BD）对纯GFP+群体进行分类。使用PicoPure试剂盒（ThermoFisher Scientific）提取RNA。使用生物分析仪2100（安捷伦技术）检查RNA质量。按照制造商的建议，使用Ovation Solo RNA-Seq系统（NuGen）获得索引cDNA文库。将复合文库（18 pM）加载到流式细胞上，并使用HiSeq 1500（Illumina）的HiSeq PE Cluster Kit v4和TruSeq SBS Kit v3-HS生成序列。使用STAR软件根据小鼠参考基因组（GRCm38.p4/mm10）绘制成对读取，以生成每个样本的读取比对。注释Mus_musculus。GRCm38.87.gtf来自ftp。Ensembl.org。

为了进行转录定量，从UCSC基因组浏览器数据库（mm10）检索所有参考序列（RefSeq）转录注释。使用featureCounts量化成绩单(廖等，2014)使用UCSC RefSeq基因注释的软件工具（仅外显子，基因作为元特征）。使用EdgeR rpm函数估计正常表达水平，并在将低FPKM重置为1以消除背景影响后，转换为log2 FPKM（每百万映射读取外显子千基片段数）。使用edgeR方法进行差异分析（准似然检验）(McCarthy等人，2012年). edgeR模型是通过两个不同时间点（MS和LS）的胚胎中胚层与胚外中胚层之间的双配对比较构建的。首先，使用R-glmQLFit方法将计数数据拟合到拟似然负二项广义对数线性模型。为了识别差异表达基因，使用适用于拟合数据的经验贝叶斯拟似然F检验（glmQLFTest方法）对零假设EM_E7.0==EEM_E7.0和EM_E7.25==EEM _E7.25进行检验。然后使用Benjamini-Hochberg P值调整方法对F-test P值进行多重测试校正。表达水平高于背景水平（百万分之平均对数计数>0）、绝对折叠变化>2和低错误发现率（FDR<0.05）的转录物被视为差异表达。

应用t分布随机邻域嵌入（tSNE）降维方法生成样本可视化图(Van Der Maaten和Hinton，2008年)至log2 FPKM表达水平（所有转录本）。应用“Rtsne”库中的R tSNE方法，而不执行初始PCA还原，并将困惑参数设置为2。使用brewer.pal调色板使用R heatmap.2方法生成热图。使用DAVID软件进行GO分析(Huang等人，2009年).

数据可用性

RNASeq数据的标准化读取计数已保存在Dryad中（doi:10.5061/Dryad.8g1nn0j）。所有其他数据都包含在手稿和支持文件中。图1、2、3、4和6提供了源数据。

生成了以下数据集
    1. 赛卡利B
    2. 马赛亚·N
    3. 纳哈布W
    4. Racu M公司
    5. 碎片整理M
    6. 米吉奥特一世
    (2018) Dryad数字仓库
    数据来自：早期小鼠胚胎的胚外和胚胎区域的不同中胚层迁移表型。
    https://doi.org/10.5061/dryad.8g1nn0j

工具书类

    1. 加利福尼亚州伯德萨尔
    2. 达姆斯基CH
    3. 佩德森RA
    (1993)
    E-cadherin和整合素在哺乳动物原始条纹中胚层分化和迁移中的作用
    开发 118:829–844.
    1. Downs公里
    2. 戴维斯T
    (1993)
    解剖显微镜下形态学标志对原肠胚小鼠胚胎的分期
    开发 118:1255–1266.
    1. 金德SJ
    2. 曾特（Tsang TE）
    3. 昆兰GA
    4. 哈贾托纳基斯AK
    5. 纳吉A
    6. Tam PP公司
    (1999)
    小鼠胚胎原肠胚形成过程中中胚层细胞向胚外结构和前后轴的有序分配
    开发 126:4691–4701.
    1. 金德SJ
    2. 曾特（Tsang TE）
    3. Wakamiya M公司
    4. 佐佐木H
    5. 贝林格RR
    6. 纳吉A
    7. Tam PP公司
    (2001)
    小鼠原肠胚的组织者由轴向中胚层的动态祖细胞群组成
    开发 128:3623–3634.
    1. 劳森KA
    2. 梅内塞斯JJ
    3. 佩德森RA
    （1991年）
    小鼠胚胎胚层形成过程中外胚层命运的克隆分析
    开发 113:891–911.
    1. Nieto文学硕士
    2. Gilardi-Hebenstreit P公司
    3. 查内·P
    4. 威尔金森总经理
    (1992)
    一种与后脑和中胚层节段模式相关的受体蛋白酪氨酸激酶
    开发 116:1137–1150.
    1. 施皮格曼M
    2. Bennett D公司
    (1974)
    正常和突变小鼠胚胎早期中胚层细胞迁移的精细结构研究（T位点：T-9/T-9）
    胚胎学与实验形态学杂志 32：723–728。
    1. 范德马滕LJP
    2. Hinton GE公司
    (2008)
    使用t-sne可视化高维数据
    机器学习研究杂志 9:2579–2605.

文章和作者信息

作者详细信息

  1. Bechara Saykali公司

    比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学IRIBHM
    贡献
    概念化、形式化分析、验证、调查、可视化、方法论、写作审查和编辑
    相互竞争的利益
    没有宣布竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0002-9097-687X

  2. 纳夫里塔·马蒂亚

    比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学IRIBHM
    贡献
    概念化、形式化分析、调查、可视化
    与
    沃利斯·纳哈布
    相互竞争的利益
    未申报竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0001-6525-7796

  3. 沃利斯·纳哈布

    比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学IRIBHM
    贡献
    概念化、软件、形式分析、验证、调查、可视化、方法论、写作审查和编辑
    与
    纳夫里塔·马蒂亚
    相互竞争的利益
    没有宣布竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0001-8283-097X

  4. 玛丽·露西·拉库

    比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学IRIBHM
    贡献
    调查、可视化
    相互竞争的利益
    没有宣布竞争利益

  5. 拉蒂法·哈姆穆

    比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学IRIBHM
    贡献
    调查、可视化
    相互竞争的利益
    没有宣布竞争利益

  6. Matthieu Defrance公司

    布鲁塞尔大学间生物信息研究所，布鲁塞尔自由大学，比利时布鲁塞尔
    贡献
    形式化分析、验证、可视化、方法
    相互竞争的利益
    没有宣布竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0002-3090-3142

  7. 伊莎贝尔·米吉奥特

    1. 比利时布鲁塞尔布鲁塞尔自由大学IRIBHM
    2. 瓦隆生命科学和生物技术卓越奖，比利时瓦隆尼亚
    贡献
    概念化、资源、形式分析、监督、资金获取、验证、调查、可视化、方法论、撰写初稿、项目管理、撰写审查和编辑
    用于通信
    imigeott@ulb.ac.be
    相互竞争的利益
    没有宣布竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0002-8972-8211

基金

科学基金会-FNRS（PDR T008416）

  • 伊莎贝尔·米吉奥特

Wallon卓越生命科学和生物技术（Welbio CR-2015S-02）

  • 伊莎贝尔·米吉奥特

基金会擦除

  • 伊莎贝尔·米吉奥特

伊拉斯穆斯·穆杜斯·菲尼克斯（研究生奖学金）

  • 贝查拉·萨卡利

Fonds Alice et David van Buuren（研究生奖学金）

  • 纳夫里塔·马蒂亚

Jaumotte-Demoulin基金会（研究生奖学金）

  • 纳夫里塔·马蒂亚

Fonds De La Recherche Scientifique-FNRS（研究生奖学金）

  • 贝查拉·萨卡利
  • 纳夫里塔·马蒂亚

资助者不参与研究设计、数据收集和解释，也不参与将研究成果提交出版的决定。

致谢

我们感谢ULB（Erasme Campus）的动物馆、FACS和光学显微镜（LiMiF）核心设施，以及布鲁塞尔大学间基因组学高通量核心(www.brightcore.be网站). 我们感谢M Martens和J-M Vanderwinden对共焦成像的帮助，A Lefort和F Libert对RNA测序的帮助，C Brakebusch、A Gossler、V Tybulewicz和L Machesky对鼠标线的友好分享，以及A Zwijsen、J Bloomekatz和E Urizar对手稿的建设性评论。BS先后获得了伊拉斯谟·蒙杜斯·菲尼克斯的奖学金和FRS/FRIA的奖学金。NM获得了FRS/FRIA的奖学金，以及“David et Alice van Buuren基金会”和“Jaumotte Demoulin基金会”的支持。WN得到了WELBIO的支持。IM是一名FNRS研究助理，也是WELBIO研究人员。WELBIO、FNRS和基金会Eraseme支持这项工作。作者声明没有财务或非财务竞争利益。

伦理学

动物实验：根据欧洲指南，动物群落在经过认证的动物设施中进行维护。该研究方案由埃塞俄比亚动物委员会（CEBEA）批准（方案394N和576N）

版本历史记录

  1. 收到日期：2018年9月28日
  2. 接受日期：2019年3月11日
  3. 发布的记录版本：2019年4月5日（第1版）

版权

©2019，Saykali等人。

本文根据知识共享署名许可协议，它允许不受限制的使用和重新分配，前提是原始作者和来源都是可信的。

韵律学

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  1. 贝查拉·萨卡利
  2. 纳夫里塔·马蒂亚
  3. 沃利斯·纳哈布
  4. 玛丽·露西·拉库
  5. 拉蒂法·哈姆穆
  6. 马蒂厄·德夫兰斯
  7. 伊莎贝尔·米吉奥特
(2019)
早期小鼠胚胎胚外和胚胎区中胚层迁移的不同表型
电子生活 8：e42434。
https://doi.org/10.7554/eLife.42434

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类别和标签

研究生物

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