乌干达疟疾耐药性、免疫学、监测和建模项目
牵头机构：加利福尼亚大学旧金山分校
研究领域
乌干达疟疾耐药性、免疫学、监测和建模项目（PRISM）代表了ICEMR网络的东非地区。乌干达是高负担国家面临挑战的象征，常规监测系统不足以评估疟疾负担的趋势或监测控制干预措施的影响。通过PRISM，研究人员实施了一项全面的疟疾监测计划，包括在不同传播强度的地区加强基于卫生设施的监测和详细的纵向队列研究。以实验室为基础的补充性研究包括监测抗疟药物和杀虫剂耐药性的标记、疟疾暴露的血清学测量、检测无性和性寄生虫的高度敏感的分子分析以及评估人与蚊子传播的膜喂养分析。这些研究大大提高了我们对乌干达疟疾流行病学和控制干预措施影响的了解。近年来，该项目扩大了疟疾监测工作和纵向研究的范围，以解决寄生虫、蚊子媒介和人类宿主之间相互作用的更基本问题。
该项目包括五个研究项目：
- 监测项目：在乌干达各地的70个卫生设施收集患者个人层面的数据。这些数据用于监测疟疾负担的时间和地理趋势，并评估人口水平控制干预措施的影响。
- 抗药性项目：使用在多个地点随时间收集的样本来描述药物和杀虫剂抗药性的表型和基因型标记的演变，并评估这些标记对疟疾传播的影响。
- 流行病学项目：使用来自队列的纵向样本来确定确定子孢子接种（受感染蚊子的叮咬）是否会导致血液期感染的因素，并确定影响血液期感染持续时间、密度和临床后果的因素。
- 传播项目：使用来自队列的纵向样本来确定与配子体产生相关的因素（感染蚊子的人类宿主体内寄生虫生命周期的性阶段），评估人类宿主对蚊子媒介的传染性，并确定人类传染源的特征。
- 实施项目：利用基于卫生设施的疟疾监测数据，估计卫生设施周围目标地区的疟疾发病率。这些数据和补充性横断面调查是在国家长效驱虫蚊帐分发计划的背景下，对两种不同的新一代长效杀虫蚊帐进行的集群随机试验的一部分。
这些高度相关的项目正在不同疟疾流行病学和不同人口水平控制干预的环境中进行，以提供必要的关键信息，优化乌干达控制和最终消除疟疾的战略。
主要成就
使用强化的基于卫生设施的监测来监测疟疾负担的时间和地理趋势，并评估人口水平控制干预措施的影响
疟疾监测包括对疟疾控制工作的监测和评估，对于指导项目规划和管理至关重要。大多数疟疾控制项目依靠定期收集的卫生设施数据来满足监测需求。然而，由于报告不完整、准确性差、诊断测试有限以及对疾病负担总体衡量的依赖，这些数据往往不足以监测趋势。2006年，成立了乌干达疟疾监测方案，与乌干达国家疟疾控制司合作，在六个大容量公共卫生设施（也称为疟疾参考中心）收集高质量的疟疾监测数据。在PRISM的支持下，监测网络从2014年扩展到2020年，包括位于全国38个地区的70个MRC。个人层面的数据通过电子方式从向MRC提供的所有门诊患者收集。这些数据用于监测疟疾负担的时间和地理趋势，并评估人口水平控制干预的影响。例如，在重复的全国LLIN分发活动中，PRISM研究人员表明，停止IRS会导致疟疾发病率在10个月内增加5倍，但恢复IRS会导致8个月内减少5倍以上。在实施IRS的地区，持续使用4年后，疟疾发病率下降了85%。这些数据突出了在LLIN覆盖率较高的国家持续增加IRS的好处，以及如果IRS停止，疟疾复发的风险。
自2018年以来，重点一直放在收集向MRC就诊的所有患者的居住村数据上。这些数据，加上MRC周围目标地区的确定和估计这些目标地区人口的计数调查，使研究人员能够估计目标地区的疟疾发病率。这些疟疾发病率估计值将是一项分组随机试验的主要结果，该试验已纳入2020-2021年在乌干达全国开展的LLIN普遍分发活动。在这项分组随机试验中，PRISM将比较两种新一代LLIN：用拟除虫菊酯+胡椒基丁醚（PBO）处理的PermaNet 3.0 LLIN和用拟除害菊酯杀虫剂+吡洛芬处理的皇家卫队LLIN。
使用详细的队列研究来提高我们对不同环境下疟疾流行病学的了解
PRISM一直站在各种流行病学环境下代表性队列进行详细纵向研究的前沿。这些研究涉及招募代表不同传播强度地区人口的住户和社区一级的控制干预措施。2011年10月至2016年6月，在三个不同传播强度的地区进行了第一系列队列研究（PRISM 1队列研究）。
PRISM 1研究发现，在普遍发放LLIN的情况下实施室内滞留喷洒（IRS）后，最高传播强度现场（托罗罗区纳贡格拉县）的疟疾负担大幅降低。为了进一步调查这一现象，更好地了解在成功疟疾控制干预的背景下疟疾的流行病学，2017年10月至2019年10月在纳贡格拉进行了PRISM 2队列研究。采用与先前队列研究类似的方法，进行更频繁的常规访视（每四周一次）。在两年的随访中，仅诊断出38例疟疾发作（发病率0.04例/人/年），没有严重疟疾或疟疾死亡病例。在托罗罗采取了五年的强化病媒控制措施后，疟疾的传播负担降低到了非常低的水平。然而，很大一部分人口仍然存在寄生虫病，主要是患有亚显微寄生虫病的学龄儿童，这为疟疾传播提供了潜在的蓄水池。
目前，PRISM研究人员正在与一个地区（Busia）接壤的一个地区进行第三次队列研究（边境队列研究），该地区尚未实施IRS，疟疾负担较高，而邻近地区（Tororo）实施IRS已超过5年，疟疾负担预计将低得多。PRISM 2队列研究中使用了类似的方法，以便比较关键的疟疾指标，如疟疾发病率、寄生虫流行率的重复测量值，以及在传播强度连续过程中的各种昆虫学测量值。
利用分子工具更好地了解血液期感染的流行病学
在乌干达等高度流行的国家，疟疾寄生虫库是动态的，包括有症状和无症状感染。无症状感染占寄生虫库的很大一部分，这一点很重要，因为研究表明，即使是亚微观（低于显微镜检测水平的低密度感染）无症状感染也可以将寄生虫传播给蚊子。在PRISM队列研究中，研究人员除了使用显微镜外，还使用了一种高度敏感的定量PCR分析来纵向评估每个参与者的寄生虫密度。这使他们能够在PRISM 1研究中描述恶性疟原虫寄生虫库随时间变化的大小和组成，并检查室内残留杀虫剂喷洒（IRS）对寄生虫库的影响，IRS是一种高效的媒介控制技术。研究发现，IRS与所有年龄组的症状性疟疾发病率显著下降相关（5岁以下儿童的人均年发病率从3.98下降到0.13，5-10岁儿童的人均发病率从2.30下降到0.15，成年人的人均年患病率从0.41下降到0）。虽然IRS显著降低了寄生虫病的患病率，但患病率仍然很高（IRS前至第三轮后：5岁以下儿童为58.5%至11.3%，5-10岁儿童为73.3%至23.7%，成人为52.2%至15.4%）。值得注意的是，在所有年龄组中，大多数残余寄生虫库都是亚微观的。这些研究结果可能有助于解释在乌干达北部和其他地方观察到的IRS退出后疟疾迅速死灰复燃的原因，并强调在我们旨在消除传染源时，可能需要将IRS与其他有效干预措施结合起来。
除了通过qPCR表征感染特征外，PRISM还使用扩增子深度测序来对寄生虫DNA进行基因分型。这使他们能够跟踪队列参与者中的单个克隆（菌株），并研究这些感染随时间的动态。由于多克隆感染可能是由共同感染（一次蚊子叮咬传播多个克隆）或双重感染（多次叮咬）引起的，因此有必要进行基因分型以区分感染中存在的克隆，以评估感染的分子力（mFOI），或随着时间的推移获得的具有不同基因的寄生虫克隆的发病率，并估计感染清除率。在PRISM 2队列中，扩增子测序用于估计无症状恶性疟原虫感染的清除率，发现即使在调整了年龄、基线感染状态和寄生虫密度后，女性仍以比男性更快的速度清除感染。没有证据表明通过行为或mFOI测量的感染暴露存在性别差异。这些发现促使合作免疫学家更好地描述宿主对疟原虫反应的性别差异。
PRISM研究人员还使用了放大深度排序来更好地理解传输动力学。通过仔细表征人类参与者的感染情况，研究人员可以在膜喂养实验中追踪哪些寄生虫克隆被传播给蚊子。接下来，研究人员将继续使用定量PCR和扩增子深度测序来阐明PRISM边境队列中感染的宿主动态。PRISM研究人员还计划在最新队列中描述非恶性疟原虫物种的流行情况。
使用分子工具和膜喂养试验更好地了解人与蚊子之间的传播
PRISM在两个不同的队列中检测了人类疟疾传染源。关键问题是：不同诊断方法（显微镜、分子定量PCR）对感染传播的贡献与其可检测性的关系；不同年龄组对传播的贡献；以及寄生虫携带的持续时间与其传播潜力的关系。
在第一个队列中（托罗罗区；2017年10月至2019年10月），通过qPCR检测的疟原虫流行率在入学时较低（17.4%），在随访期间，受感染个体中的寄生虫流行率和寄生虫密度均下降。在这一群体中，研究人员使用蚊子摄食试验和配子细胞携带和克隆复杂性的分子分析来检测人类疟疾感染源，这代表了在加强疟疾控制后疟疾传播大幅下降的许多非洲环境。他们发现，在寄生虫阳性个体中，疟疾寄生虫（配子细胞）传播期的流行程度取决于临床表现。在临床疟疾病例中，许多患者有近期感染的证据，配子细胞的患病率为28.9%。相比之下，无症状个体的配子细胞患病率为67.6%（p=0.033）。他们对临床疟疾病例或无症状感染者的血液样本进行了总共538次蚊子膜喂养试验。在这些实验中，39只（7.2%）至少观察到一只受感染的蚊子，37404只蚊子中有446只（1.2%）受到感染。研究人员观察到，配子细胞密度强烈预测了感染至少一只蚊子的可能性以及感染蚊子的比例。配子细胞密度分布因人群而异，在无症状显微镜下检测到的疟疾感染中，配子细胞的密度总体上最高，而在临床疟疾病例和无症状亚显微感染中，其密度较低。他们还发现，临床症状降低了配子细胞的传播能力。同时考虑其在人群中的流行程度及其对蚊子的传染性，无症状显微镜阳性个体占感染库的83.8%，无症状qPCR检测到的感染占15.6%，有症状的感染占50，占传播的0.6%。他们进一步估计，5至15岁的儿童占传染源的58.7%，其次是5岁以下的儿童（25.8%），以及16岁或以上的儿童（15.6%）。研究人员对75名受试者进行了反复蚊子喂食试验，以纵向监测感染情况。值得注意的是，四名儿童（占总人口的0.8%）感染了62.6%的蚊子。这些儿童的感染有时是慢性的，但有时感染持续时间较短。
PRISM研究人员目前正在一个传播强度明显较高的地区（托罗罗布西亚边境地区）进行类似的研究。研究开始时（2020年8月至9月），qPCR寄生虫流行率在随访的前6个月相对较高。在总共340只饲料中，33只感染性蚊子（9.7%）导致至少一只感染蚊子，其中1.2%的蚊子（283/23247）受到感染。尽管传播强度显著不同，但结果却非常相似。在随机挑选的645名qPCR阳性个体中，配子体的流行率在临床病例中再次降低，配子细胞密度与蚊子感染率密切相关。同样，感染者中很少有年龄大于15岁的人（1/33感染者；1/283感染蚊子）。研究人员得出结论，在儿童无症状感染的持续传播过程中，感染部位之间存在显著的一致性。
抗疟药物和杀虫剂耐药性措施的时间和地理趋势
耐药性PRISM研究人员一直在使用各种来源的样本监测耐药性趋势。他们对已知的耐药标志物进行了定期监测，早年在三个地点进行了调查，2016-17年在10个地点进行调查，自2018年以来在乌干达周围的16个地点进行。考虑到对旧药物的耐药性标志物，与氯喹和相关氨基喹啉耐药性相关的pfcrt和pfmdr1突变的发生率已降至较低水平；在全国范围内，pfdhfr和pfdhps中5种突变的流行率仍然很高，这5种突变介导了对磺胺多辛-乙胺嘧啶（SP）的中度耐药，另外两种突变pfdhfr164L和pfdhps581G的流行率也有所增加，尤其是在乌干达西部。妊娠期采用间歇性预防性治疗，选择与耐药性相关的SP突变。最令人担忧的是pfK13的突变可能介导对青蒿素的耐药性。他们发现三种PfK13突变的患病率越来越高，即乌干达北部的469Y和675V，最近乌干达西南部的469F。PRISM研究人员还定期对在其Tororo实验室附近采集的恶性疟原虫分离株的体外药物敏感性进行表征，2021年6月至7月，研究人员将这些研究扩展到乌干达北部阿加戈地区采集的样本。目前正在进行研究，以确定感兴趣的基因型和体外表型之间的相关性。总的来说，近年来的监测和实验室研究表明，对氨基喹啉类抗疟药的敏感性有所提高，对SP耐药性恶化的迹象，以及一些预测青蒿素类抗疟药耐药性的标志物的出现令人担忧。继续监测、实验室和临床研究以评估耐药性是一个高度优先事项。
杀虫剂抗性对拟除虫菊酯杀虫剂敏感性的常规监测显示，对主要用于长效杀虫剂蚊帐（LLIN）的I类（氯菊酯）和II类（溴氰菊酯）拟除虫菊酯类杀虫剂具有高度耐药性。还记录了杀虫剂对另一类杀虫剂的耐药性，即氨基甲酸酯（含苯双甲威）。对这一类抗药性的潜在驱动机制的研究表明，乙酰胆碱酯酶-1基因中没有目标位点突变G119S，该基因在西非广泛存在，但在苯二甲酸存活者中唾液腺基因表达存在显著且意想不到的关联。多年来，PRISM一直在对一些蚊子种群进行新的杀虫剂抗性标记检测，这项工作的成果是发现了两种新的单核苷酸多态性（SNP），即：；与拟除虫菊酯代谢抗性相关的细胞色素P450 Cyp4j5和酯酶Coae1d。PRISM项目为冈比亚按蚊1000基因组项目提供了样本，以检测这种非洲疟疾载体的遗传多样性。该资源在发现其他抗药性模式方面发挥了重要作用，包括拷贝数变异在介导抗药性中的重要性。PRISM与其他ICEMRs合作，绘制了整个ICEMRs的杀虫剂耐药性图，并缩小了知识差距。他们还记录了同域冈比亚按蚊和阿拉伯按蚊之间当代基因流动的证据，这与室内残留喷洒活动导致阿拉伯按蚊数量增加有关。他们目前正在研究最近发现并迅速传播的细胞色素P450基因簇中的三个突变对拟除虫菊酯抗性的影响，这三个突变构成了Cyp6p4（I236M）（一种类似桑给巴尔的转座元件（TE））的非同义点突变以及从11个地点采集的样本中Cyp6aa1基因的重复。这种三重突变与冈比亚按蚊的高代谢抗性有关。总的来说，PRISM对杀虫剂耐药性的监测显示，对拟除虫菊酯的耐药性很高，对氨基甲酸酯类药物的耐药性正在出现。由于有机磷（甲基嘧啶磷）用于室内残留喷洒，PRISM研究人员一直在监测杀虫剂对其他类别特别是有机磷的敏感性。他们打算扩大监测杀虫剂对新一代杀虫剂的敏感性的范围，如用于当前病媒控制的氯噻奈丁（一种新烟碱类）和氯芬那吡（一种吡咯）。
学分：
Teun Bousema，Radboudumc公司
区域影响
最近，在整个非洲，控制干预措施的规模急剧增加，疟疾负担减轻。然而，进展并不一致，事实上，乌干达等负担最重的国家进展最慢。疟疾覆盖了该国广泛的流行病环境。ICEMR正在乌干达各地的卫生中心和人群中进行研究，从传播强度相对较低的地区到世界上有记录以来传播强度最高的地区。研究人员希望使用不同的设置来评估干预策略和评估最佳控制方法。
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工作人员
首席研究员：格兰特·多尔西，医学博士
项目负责人
- 监测：Joaniter I.Nankabirwa，Makerere大学和传染病研究合作组织（IDRC），乌干达
- 流行病学：Moses R.Kamya，Makerere大学和传染病研究协作组织（IDRC），乌干达
- 抵抗：Samuel Nsobya，Makerere大学和乌干达IDRC
- 传播：Sarah Staedke，英国伦敦卫生与热带医学院。
- 实施：Moses R.Kamya，Makerere大学和传染病研究合作组织，乌干达
合作机构
- 传染病研究协作组织（IDRC），乌干达坎帕拉
- 乌干达坎帕拉马克雷雷大学健康科学学院
- 英国利物浦热带医学院
- 英国伦敦卫生与热带医学院
- 荷兰Radboud健康科学研究所
- 斯坦福大学，加利福尼亚州斯坦福
- 英国达勒姆达勒姆大学
- 华盛顿州西雅图健康指标与评估研究所
出版物
东非ICEMR的PubMed出版物.
