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.1998年7月7日；95(14):8292-7.
doi:10.1073/pnas.95.14.8292。

ARF抑癌基因与p53和Mdm2的功能和物理相互作用

T卡米乔 1, J D韦伯, G赞贝蒂, F津迪, M F Roussel先生, C J谢尔
附属公司

ARF抑癌基因与p53和Mdm2的功能和物理相互作用

T卡米乔等。 美国国家科学院程序. .

摘要

INK4a-ARF基因座编码两种蛋白，p16（INK4a）和p19（ARF），分别通过影响视网膜母细胞瘤蛋白和p53的功能来抑制细胞生长。由于缺失或点突变而破坏该基因座是人类癌症中常见的事件，可能仅次于p53的缺失。利用感染杆状病毒载体的昆虫细胞和感染ARF逆转录病毒的NIH 3T3成纤维细胞，我们确定小鼠p19（ARF）可以直接与p53以及p53调节因子mdm2相互作用。ARF可以结合p53-DNA复合物，并且依赖功能性p53转录诱导mdm2和细胞周期素依赖性激酶抑制剂p21（Cip1），并阻止细胞增殖。p19（ARF）与p53的结合需要ARF N末端结构域（氨基酸1-62），这对于诱导细胞周期阻滞是必要的和足够的。野生型或ARF-null小鼠胚胎成纤维细胞中p19（ARF）的过度表达使p53的半衰期从15分钟增加到约75分钟，与p53依赖性转录反应增加和生长停滞相关。令人惊讶的是，当引入ARF-null NIH 3T3细胞或小鼠胚胎成纤维细胞后在超生理水平上过度表达时，p53蛋白在诱导这种检查点反应时受到阻碍。在这种情况下，p19（ARF）的再次引入恢复了p53诱导p21（Cip1）和mdm2的能力，这意味着除了稳定p53外，ARF还通过一种额外的机制调节p53依赖性功能。

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数字

图1
图1
ARF稳定p53并诱导p53依赖性基因表达。(A类)MEF在感染编码p19的逆转录病毒48小时后被裂解农业研究基金，C端截断p19农业研究基金突变体（N84、N62）或N末端截断的ARF突变体（Δ1–62）。使用p53、p21抗体通过直接免疫印迹法检测蛋白质Cip1号机组和mdm2，如左边距所示。(B类)感染p19指定时间MEF提取RNA的Northern blot分析农业研究基金或控制逆转录病毒载体。未感染的增殖细胞表达p53、p21水平Cip1号机组和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GDH）RNA与感染对照载体的细胞中检测到的RNA相同。(C类)感染36小时后(顶部)或p19自动射频逆转录病毒(底部),自动射频-零MEF脉冲1小时[35S] 蛋氨酸和追赶在含有过量未标记前体的培养基中。在变性凝胶上解析标记后在指定时间裂解的细胞中沉淀的p53。
图2
图2
功能p19农业研究基金与mdm2和p53结合，可形成三元复合物。(A类)Sf9细胞与编码野生型p53和任一p19的杆状病毒共感染48小时农业研究基金或指示的p19农业研究基金用myc（9E10）、p53（PAb 421）对照抗体、ARF C末端亲和纯化抗体或抗HA（检测HA标记的N62）裂解并沉淀突变体。将变性凝胶分离的免疫复合物中的蛋白质转移到过滤器中，并用抗ARF或抗HA（针对N62）进行免疫印迹检测。(B类)与中所示类似的实验A类使用指定的p53突变体（前两个面板）进行。Sf9细胞也与所示的p53突变体和mdm2复合感染(底部)记录22/23/281突变株不能结合mdm2。用PAb421或抗体2A10沉淀的蛋白质对mdm2进行电泳分离、转移和2A10印迹。(C类)对感染了以下各面板所示病毒的Sf9细胞进行裂解，并用非免疫血清（NRS）、ARF C末端抗体、PAb421（p53）或抗体2A10（mdm2）孵育，如每条泳道顶部所示。用mdm2抗体印迹溶解的蛋白质(顶部)，p53(中部)或ARF(底部)同上。
图3
图3
p19的直接相互作用农业研究基金和p53。(A类)用所示抗体对感染ARF病毒的NIH 3T3细胞的裂解物进行顺序沉淀[（IP），1-4通道]。分离沉淀蛋白并用mdm2、p53和ARF抗体进行印迹。(B类)使用含有两个共有p53结合位点的末端标记寡核苷酸进行EMSA（40）。对结合反应的添加显示在车道下方，包括激活抗体PAb-421、10倍过量的冷未标记寡核苷酸（竞争对手）、纯化的重组p53和从感染了编码ARF或无重组蛋白的杆状病毒载体（对照，CTL）的细胞中提取的Sf9提取物。箭头表示p53-oligonnucleotide复合物和ARF超移的位置。
图4
图4
p21的诱导Cip1号机组ARF或p53逆转录病毒载体。单独感染载体（1–3道）的细胞，一种编码HA-标记p19的逆转录病毒农业研究基金感染48小时后，检测编码野生型p53的载体（6-8巷）。凝胶上分离的蛋白质进行p53免疫印迹(顶部)，第21页Cip1号机组(中部)和第19页农业研究基金(底部)如左图所示。包括感染细胞第53页-零早期通行MEF（1号和6号车道），野生型MEF（3号和5号车道）。和8），或早期通过农业研究基金-零MEF（车道2、4和7）。内源性p19农业研究基金p53阳性细胞（第1通道）中升高，在感染p53病毒（第6通道）后被抑制。HA-标记的ARF（用星号表示）迁移速度比内源性蛋白质慢。在48小时时通过加入[三H] -复制板中的胸苷。
图5
图5
ARF和p53的反激活。NIH 3T3或10（1）成纤维细胞用野生型PG13-CAT（WT）或突变型MG15-CAT（Mut）和增加量的p19瞬时转染农业研究基金或p53。在A类和B类第2-4和6-8通道中的ARF质粒输入为1、2和5μg DNA，而在B类（5-8车道）。在C类，细胞未接受ARF DNA（泳道1-4）或1μg ARF质粒（泳道5-8）加1、2或5μg p53质粒（分别为泳道2-4和6-8）。转染48小时后制备的细胞裂解液用于CAT活性分析。单乙酰化物和双乙酰化物分别位于板块的中部和顶部。通过密度计计算并在车道下方显示的二乙酰化形式的信号强度标准化为1.0(A类，车道1）。
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