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.1998年4月；18(4):2392-405.
doi:10.1128/MCB.18.4.2392。

人类T细胞白血病病毒1型Tax突变体的差异转录激活是通过与CREB结合蛋白和p300的不同相互作用介导的

F Bex公司 1, M J尹, 烧伤, R B盖诺
附属公司

人类T细胞白血病病毒1型Tax突变体的差异转录激活是通过与CREB结合蛋白和p300的不同相互作用介导的

F Bex公司等。 分子细胞生物学. 1998年4月.

摘要

人类T细胞白血病病毒1型Tax蛋白可转化人类T淋巴细胞，从而导致成人T细胞白血病的发展。税收转化与其通过ATF/CREB和NF-kappaB途径激活基因表达的能力有关。这些途径的转录激活由相关辅活化因子CREB结合蛋白（CBP）和p300的作用介导。在本研究中，免疫细胞化学和共聚焦显微镜用于在表达野生型Tax或Tax突变体的细胞中定位CBP和p300，这些突变体能够选择性激活NF-kappaB或ATF/CREB途径的基因表达。野生型Tax与CBP和p300在核体内共定位，核体内还含有ATF-1和NF-kappaB的RelA亚单位。然而，Tax突变体仅选择性激活与CBP共定位的ATF/CREB途径而非p300的基因表达，而Tax突变型仅选择性激活NF-kappaB途径与p300共定位而非CBP的基因表达。体外和体内蛋白质相互作用研究表明，这些突变体所描述的Tax的两个独立结构域的完整性参与了Tax与CBP或p300的直接相互作用。这些研究与一种模型一致，即特定Tax突变体激活NF-kappaB或ATF/CREB途径是通过与相关辅活化蛋白的不同相互作用介导的。

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数字

图1
图1
Tax突变体对NF-κB和ATF/CREB通路的差异激活。（A） 353-aa Tax蛋白的示意图。显示了三个Tax突变体F1、M148和M47的氨基酸变化位置。（B） 对用SFV-Tax感染0小时（泳道1）、6小时（泳道2）、12小时（泳道3）、18小时（泳道4）或24小时（泳道5）的BHK21细胞制备的提取物进行蛋白质印迹分析。BHK21细胞感染对照SFV（第6车道）、SFV-Tax WT（第7车道）、SFV-Tax F1（第8车道）、SVV-Tax M47（第9车道）或SFV-TaxM148（第10车道），持续18小时。细胞提取物在SDS–15%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并使用针对Tax的单克隆抗体进行Western blot分析。分子量（MW）单位为千，如左图所示。（C） 用1μg HTLV-1 CAT或HIV-1 CAT报告质粒转染BHK21细胞；转染后5 h，用对照SFV（WT）、SFV-Tax WT、SFV-Tax F1、SFV-Tax M47或SFV-Tax M148感染细胞，24 h后收获。然后测定细胞提取物的CAT活性，计算野生型或突变型Tax对三个独立实验的折叠诱导，并显示标准偏差。
图2
图2
CBP和p300抗体的特异性。用兔抗CBP（A）多克隆抗体或抗p300（B）单克隆抗体对BHK21细胞裂解物进行Western blot分析。
图3
图3
CBP和p300分布在明显的核斑点中。用识别CBP（a）的兔多克隆抗体或p300（C）的单克隆抗体对未感染的BHK21细胞进行固定和单免疫荧光染色分析。抗CBP抗体也与抗剪接因子Sm（B）的单克隆抗体或抗p300（D）的单抗联合使用。抗p300抗体与Sm（E）单克隆抗体联合使用。DNA染色TO-PRO-3用于染色细胞核（A和C）。右边的面板显示了蓝色和绿色染色或红色和绿色染色的叠加。
图4
图4
美国海关与边境保护局（CBP）和p300与核机构中的野生型税收共同定位。BHK21细胞感染SFV-Tax（A和B）、SFV-Tax-M47（C和D）或SFV-TaxM148（E和F）18小时。用Tax单克隆抗体结合特异性识别CBP的兔多克隆抗体（a、C和E）或Tax的兔多克隆抗体和p300的单克隆抗体（B、D和F）通过双重免疫荧光固定和染色细胞。右边的面板显示了红色和绿色荧光染色的叠加。
图5
图5
Tax中的独立域调节了与CBP和p300的交互作用。将单独的GST（泳道2、6、10和14）、GST-CBP（aa 450至682）（泳道3、7、11和15）或GST-p300（aa 436至662）（泳道4、8、12和16）结合到谷胱甘肽琼脂糖珠上，并与500ng纯化的野生型（WT）Tax（泳道2至4）、Tax M47（泳道6至8）、Tax M148（泳道10至12）或Tax F1（泳道14至16）蛋白孵育。经过大量洗涤后，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离仍附着在珠子上的Tax蛋白，并用Tax单克隆抗体进行Western blot分析。通道1、5、9和13含有大约10%的输入Tax蛋白。分子量（单位：千）如左图所示。
图6
图6
税务与CBP和p300的体内关联。用对照SFV（Mock）或表达野生型（WT）Tax或Tax突变体F1、M47和M148的SFV感染BHK21细胞18小时。收集细胞，用Tax单克隆抗体进行共免疫沉淀试验。然后使用Tax（A）、CBP（B）和p300（C）抗体对细胞裂解物进行蛋白质印迹分析，或使用CBP（D）或p300（E）抗体对免疫沉淀复合物（IP）进行蛋白质印记分析。
图7
图7
NF-κB RelA与Tax突变体M47和M148表现出差异共定位。BHK21细胞被对照SFV（A）、SFV-Tax（B）、SFV Tax F1（C）、SFV-Tax M47（D）或SFV-TaxM148（E）感染18小时。用Tax单克隆抗体（左面板）和NF-κB RelA亚单位的兔多克隆抗体（中面板）对细胞进行固定和双重免疫荧光染色。右边的面板显示了红色和绿色荧光染色的叠加。
图8
图8
税务和RelA共同本地化评估。从感染SFV-Tax的BHK21细胞标本中采集水平切片图像（Z系列）。用Tax和RelA抗体对细胞进行双重免疫荧光染色分析。Z1至Z4是其中四个截面，以1μm的间隔收集。P是Z系列的投影。左侧面板显示Tax的LRSC荧光，中间面板显示RelA的FITC荧光，右侧面板为红色和绿色荧光染色的叠加。
图9
图9
ATF-1与Tax在核领域合作。BHK21细胞被对照SFV（A）、SFV-Tax（B）、SFV Tax F1（C）、SFV-Tax M47（D）或SFV-TaxM148（E）感染18小时。然后用兔Tax多克隆血清（左图）和特异性识别ATF-1的单克隆抗体（中图）对细胞进行固定和双重免疫荧光染色。右边的面板显示了FITC和德克萨斯红荧光的叠加。
图10
图10
Tax不与ATF/CREB蛋白质CREB和CREM共存。将未感染的BHK21细胞（A和C）或感染SFV-Tax（B和D）18小时的BHK22细胞固定，并用Tax单克隆抗体（左面板）和识别CREB（A和B）或CREM（C和D）的特异性多克隆抗体（中面板）进行双重免疫荧光染色分析。右边的面板显示了红色和绿色荧光的叠加。
图11
图11
Tax与CBP、p300和ATF-1在HTLV-1转化的淋巴细胞中存在的离散核灶中共定位。HTLV-1转化的MT2淋巴细胞（B、D和F）或T淋巴细胞Jurkat细胞（A、C和E）在显微镜载玻片上离心，固定，并用Tax单克隆抗体（左面板）和特异识别CBP（A和B）或p300（C和D）的抗体（中面板）进行双重免疫荧光染色分析。兔抗Tax多克隆抗体与抗ATF-1（E和F）单克隆抗体联合使用。右边的面板显示了红色和绿色荧光的叠加。
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