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.2023年10月：44:100935。
doi:10.1016/j.neo.2023.100935。 Epub 2023年9月15日。

HSP90 C末端结构域抑制通过降低肝细胞癌中K274单泛素化促进VDAC1齐聚

张金鑫 1, 刘丽霞 1, 李燕 1, 黄亚玲 1, 肖森波 2, 邓子豪 1, 郑振明 1, 李洁友 1, 梁曼凤 1, 谢冠泰 1, 小陈 1, 邓耀堂 1, 文冲滩 1, 苏海柔 1, 吴贵兵 1, 蔡春青（Chunqing Cai） 1, 陈雪梅 三, 邹飞 4
附属公司

HSP90 C末端结构域抑制通过降低肝细胞癌中K274单泛素化促进VDAC1齐聚

张金鑫等人。 肿瘤形成. 2023年10月.

摘要

电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1（VDAC1）是线粒体外膜中最丰富的蛋白质，在控制肝细胞癌（HCC）进展中起着关键作用。我们之前的研究发现，细胞溶质分子伴侣热休克蛋白90（Hsp90）与VDAC1相互作用，但Hsp90的C端和N端结构域对VDAC1低聚物形成的影响尚不清楚。在本研究中，我们重点研究了Hsp90的C末端结构域对VDAC1齐聚、泛素化和VDAC1通道活性的影响。我们发现，Hsp90 C末端结构域抑制剂新生霉素促进VDAC1寡聚化，释放细胞色素C，并激活线粒体凋亡途径。原子粗粒子模拟揭示了Hsp90α稳定的VDAC1单体的C末端结构域。纯化后的VDAC1被重组为平面脂质双层，膜片钳电生理实验表明，Hsp90 C末端抑制剂Novobiocin通过促进VDAC1齐聚来增加VDAC1通道电导。线粒体泛素化蛋白质组学结果表明，新生霉素处理后VDAC1 K274单泛素化显著降低。VDAC1（K274R）的定点突变减弱了Hsp90α-VDAC1相互作用，增加了VDAC1齐聚。综上所述，我们的结果表明，Hsp90 C末端结构域抑制通过降低VDAC1 K274单泛素化促进VDAC1齐聚和VDAC1通道电导，这为肝癌的线粒体靶向治疗提供了新的前景。

关键词：细胞凋亡；热休克蛋白90抑制剂；肝细胞癌；齐聚；电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1。

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竞争利益声明作者声明没有利益冲突，所有作者都同意发表手稿

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图像、图形摘要
图形摘要
图1
图1
Hsp90αC末端抑制剂新生霉素（NB）增加HepG2细胞中VDAC1齐聚、细胞色素C释放并诱导凋亡。HepG2细胞作为对照组，STA9090处理组（100 nM，24 h）或NB处理组（0.5 mM，24小时）。（A）加入交联剂乙二醇（EGS，500μM）后，通过Western blotting观察VDAC1的齐聚。（B）进行蛋白质印迹以测定HepG2细胞的线粒体和胞浆中细胞色素c的水平。（C）HepG2细胞中COXIV（红色）和细胞色素c（绿色）的共焦免疫荧光图像。刻度为20μm。下面板是COX IV（红色）/Cyto c（绿色）的共定位分析。比例尺为20μm。（D）Western印迹法检测Caspase 3和PARP的裂解。所有数据均表示平均值±SD，n=3，*p<0.05，**p<0.01。
图2
图2
VBIT-4改善新生霉素诱导的HepG2细胞和VDAC1寡聚相关凋亡。（A）用NB（0.5 mM）或NB联合VBIT-4（10μM）处理HepG2细胞24 h。与EGS交联后，通过western blot分析测定VDAC1二聚体水平。（B）Western blotting检测HepG2细胞线粒体和胞浆中细胞色素c的水平。（C）western blotting检测caspase3和PARP的裂解。所有数据均表示平均值±SD，n=3，*p<0.05，**p<0.01.（D）透射电镜显示了NB（0.5 mM）或NB联合VBIT-4（10μM）处理后HepG2细胞线粒体（黑色箭头）的形态。刻度为2μm（顶部面板）或500 nm（底部面板）。（E）细胞增殖用结晶紫染色集落生长试验检测。代表性照片和条形图来自三个独立的实验.（F）用NB（0.5 mM）或NB与VBIT-4（10μM）联合处理HepG2细胞进行跨阱侵袭试验。比例尺为200μm。数据表示为平均值±SD，n=6。*p<0.05，**p<0.01.
图3
图3
Hsp90αC末端的功能障碍促进VDAC1齐聚。（A）自由绑定期间朝向VDAC1的HSP90绑定方向示意图。（B）采用原子粗粒子模型模拟了Hsp90α-VDAC1的相互作用。膜中Hsp90α与VDAC1单体和二聚体稳定结合络合物的典型系统快照（顶面板）。膜中VDAC1单体和二聚体的俯视图（底部面板）。（C）HepG2细胞与STA9090（100 nM）或NB（0.5 mM）孵育24 h。在与交联试剂乙二醇（EGS）孵育后，用裂解物进行VDAC1与Hsp90α的共免疫沉淀。免疫印迹法分析Hsp90α、VDAC1单体和二聚体水平。（D）用编码HA标记的Hsp90α全长或HA标记的NTD-MD（ΔC）、MD（ΔC+ΔN）和MD-CTD（ΔN）结构域的质粒瞬时转染HepG2细胞。然后用交联试剂EGS处理细胞。通过蛋白质印迹分析测定HA和VDAC1二聚体水平。所有数据均表示平均值±SD，n=3，*p<0.05，**p<0.01.
图4
图4
Hsp90 C末端抑制剂新生霉素抑制VDAC1 K274的单泛素化并促进VDAC1的齐聚。（A）泛素化线粒体蛋白质质谱分析程序（左面板）以及STA9090或NB处理后VDAC1 K12、K20、K61、K109、K110和K274的不同泛素化（右面板）。实验在两个生物复制中进行。（B）用编码HA标记VDAC1 WT或K274R的质粒瞬时转染HepG2细胞36 h；EGS交联后用Western blotting分析VDAC1的齐聚。（C）Western blotting检测细胞色素c的释放。（D）通过Western blotting检测细胞裂解物对凋亡相关蛋白PARP和caspase 3的裂解。（E）HepG2细胞在不使用STA9090（100nM）或NB（0.5mM）的情况下培养24小时。通过Western blotting测定Parkin转位到线粒体的水平。（F）STA9090和NB处理24h后线粒体和胞浆泛素化测定。（G）在STA9090和NB处理24小时后，进行VDAC1 K274R单-泛素化分析（Ub1：单-Ub，Ubn：多-Ub）。（H）用STA9090或NB处理后的HepG2细胞裂解物进行VDAC1和Hsp90α的共免疫沉淀。通过Western blotting检测Hsp90α和VDAC1水平。所有数据均表示平均值±SD，n=3，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图5
图5
Hsp90 C末端抑制剂Novobiocin促进肿瘤移植中VDAC1寡聚和凋亡。HepG2-Luc细胞（1×107)裸鼠皮下注射，形成异种移植瘤。（A）注射后14天，用IVIS Lumina XRMS活体成像系统观察肿瘤发光灶。（B）注射HepG2-Luc细胞后14天，取对照组、STA9090处理组和NB处理组小鼠的异种移植瘤（左侧）和肿瘤重量（右侧）。（C）记录每两天异种移植瘤体积的增长，计算为V=0.5×L×W2（V：体积，L：长度，W：宽度）。（D） 用交联试剂EGS（500μM）处理后，通过Western blot分析观察异种移植瘤的VDAC1齐聚。每个通道代表不同的鼠标。（E） 通过Western blot分析测定异种移植瘤的裂解PARP水平。每个通道代表不同的鼠标。（F）异种移植瘤解剖标本的切割PARP和切割Capase 3抗体免疫组织化学染色。比例尺为100μm。通过ImageJ软件v1.8.0（NIH，MD，USA）对免疫组织化学图像进行定量分析，作为平均光密度（AOD）[AOD=积分光密度（IOD）SUM/面积SUM]。定量数据为每组n=6只小鼠的平均值±标准差。*p<0.05，**p<0.01.
图6
图6
VDAC1特异性齐聚抑制剂VBIT-4降低Hsp90 C末端抑制剂新生霉素-增加VDAC1通道电导。（A）将从大鼠肝线粒体纯化的VDAC1重组为平面脂质双层的膜片钳实验方案。（B）将VDAC1重组为PLB，并在添加VBIT-4（40μM）之前和30分钟后记录通过VDAC1的电流，以响应0至-10 mV的电压阶跃（C）将VDAC1重组为PLB，并在添加Hsp90α（顶板）前后记录通过VDAC1的电流，以响应0至-10 mV的电压阶跃。将纯化的VDAC 1和Hsp90α蛋白添加到PLB的顺式侧，并在新生霉素（NB）或新生霉素结合VBIT-4处理后记录通道电导（下图）。（D）将纯化的VDAC1蛋白和经STA9090处理的Hsp90α蛋白添加到PLB的顺式侧，并记录通道电导。定量数据为平均值±标准差，n=6。*p<0.05。（E）纯化的VDAC1蛋白（5μg）与Hsp90α蛋白或STA9090或NB处理的Hsp90β蛋白孵育10分钟（VDAC1:Hsp90γ=3:1）。经交联试剂EGS（500μM）处理后，通过Western blot分析观察纯化VDAC1蛋白的VDAC1齐聚。所有数据均表示平均值±SD，n=3，**p<0.01。
图7
图7
Hsp90 C末端抑制剂Novobiocin降低VDAC1 K274单泛素化，从而促进VDAC1齐聚、通道电导、细胞色素C释放和凋亡。Hsp90 C末端抑制剂NB通过破坏VDAC1 K274单体泛素化来削弱VDAC1单体的稳定性，并促进VDAC1齐聚。因此，线粒体膜间隙释放细胞色素c启动线粒体凋亡途径。VDAC1特异性齐聚抑制剂VBIT-4可减轻新生霉素诱导的VDAC1齐聚、细胞色素c释放和凋亡。
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