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.2022年7月8日；11(14):2154.
doi:10.3390/cells11142154。

敲除层粘连蛋白B1及其受体导致恶性黑色素瘤异染色质状态改变和衰老诱导

Lisa Lämmer运动衫 1, 梅兰妮·卡佩尔曼·芬奇 2, 斯特凡·费舍尔 2, 迈克拉·波默 1, 汤姆·齐默尔曼 1, 维奥拉·克鲁格 1, 亚历山大·马提斯 1, 希尔克·库法尔 1, 安贾·卡特林·博瑟霍夫 1
附属公司

敲除层粘连蛋白B1及其受体导致恶性黑色素瘤异染色质状态改变和衰老诱导

Lisa Lämmer运动衫等。 细胞. .

摘要

细胞核结构的改变与包括癌症在内的多种疾病有关。它们导致核活性、结构动力学和细胞信号的变化。然而，核膜及其相关蛋白在恶性黑色素瘤中的作用尚不清楚。其分子特征可能会导致对新治疗方法的深入理解和开发。在本研究中，我们分析了失调的核层粘连蛋白B1（LMNB1）及其核受体（LBR）的功能影响。根据它们的细胞定位和功能，我们发现这些基因与染色质组织等核过程密切相关。敲除LMNB1和LBR后的RNA测序和差异基因表达分析揭示了它们在驱动内质网应激导致衰老和染色质状态变化的重要细胞过程中的意义，这也得到了实验验证。我们确定黑色素瘤细胞需要这两种分子独立地防止衰老。因此，BRAF中两个分子的下调V600E型黑素细胞衰老模型和足叶乙甙处理的黑色素瘤细胞表明两者都是黑色素瘤的潜在衰老标志物。我们的研究结果表明，LMNB1和LBR影响衰老，并影响染色质凝聚等核过程，因此在功能上与黑色素瘤进展相关。

关键词：伦敦银行同业拆借利率；LMNB1；染色质状态；异染色质病灶；黑色素瘤；核膜；衰老。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
(A类)与NHEMs比较的不同Wistar黑色素瘤（WM）细胞系中LMNB1表达的RNA序列分析（单向方差分析和随后的Tukey多重比较试验）。(B类)原发性黑色素瘤与黑色素细胞痣中LMNB1表达的RNA序列分析（单向方差分析和随后的Tukey多重比较试验）。(C类)NHEMs和各种黑色素瘤细胞系中LMNB1蛋白表达的Western blot分析（Student’st吨-测试）。(D类)转染siLMNB1和siCtrl 72小时的MEL-JUSO和SK-MEL-28中免疫荧光LMNB1染色的代表性图像。标尺等于20µm。(E类)转染siLMNB1和siCtrl的MEL-JUSO和SK-MEL-28细胞的DAPI染色72小时。可见的异染色质病灶用蓝色箭头标记。使用Student’st吨-测试。比例尺等于20µm。(F类)使用β-actin作为管家对MEL-JUSO和SK-MEL-28中的siLMNB1和siCtrl处理72小时后H3水平进行Western blot分析（Student’st吨-测试）。条形代表平均值±SEM（*=第页≤0.05，ns=不显著）。
图2
图2
(A类)转染siLMNB1（72 h）的MEL-JUSO和SK-MEL-28的SAβ-半乳糖苷酶染色作为衰老检测（Student’st吨-测试）。(B类)用siLMNB1和siCtrl转染72小时的MEL-JUSO和SK-MEL-28中早幼粒细胞白血病蛋白（PML）表达的免疫荧光染色作为衰老检测（Student’st吨-测试）。(C类)用荧光染料碘化丙啶流式细胞术进行细胞周期染色。用siLMNB1和siCtrl处理MEL-JUSO和SK-MEL-28 72小时（学生的t吨-测试）。条形代表平均值±SEM（*=第页≤0.05，ns=不显著）。
图3
图3
(A类)利用模拟和BRAF建立衰老模型，用qRT-PCR分析LMNB1的表达V600E型与对照组（Student’st吨-测试）。(B类)Epiquik染色质可及性测定，用于验证NHEM、以Mock作为对照和BRAF转导的慢病毒中的染色质状态V600E型（建立衰老模型）和siLMNB1-长期处理黑色素瘤细胞（MEL-JUSO）与siCtrl的比较。使用siCtrl 72 h和siCtrl LTT的标准化log10%FE来排除更长时间内siCtrl转染过程的影响。(C类)长期转染siLMNB1和siCtrl的MEL-JUSO和SK-MEL-28的SAβ-Gal染色作为衰老检测（Student’st吨-测试）。(D类)与长期转染相比，转染siLMNB1 72 h的MEL-JUSO和SK-MEL-28的Sβ-Gal阳性染色百分比。各个siCtrl的β-gal阳性染色黑色素瘤细胞的百分比包括在siLMNB1 72 h和siLMNB1LTT（学生的t吨-测试）。(E类)分别用siLMNB1和siCtrl长期转染黑色素瘤细胞系MEL-JUSO和SK-MEL-28三个月。用DAPI染色分析染色质凝集并随后定量。放大后的图像显示带有蓝色箭头标记的典型染色质病灶。比例尺等于20µm。条形代表平均值±SEM（*=第页≤ 0.05).
图4
图4
(A类)差分表达的热图。第页<0.1）基因。(B类)富集图（FDR<25%）显示了运行富集分数（绿色）和富集基因集位置的剖面，以及GSEA确定的分别用siLMNB1和siCtrl处理的MM细胞中差异表达的基因的等级序列列表。图左侧以红色显示siLMNB1 MM细胞中上调的基因，右侧以蓝色显示下调的基因。(C类)差异表达基因可能表达的基因产物的最大蛋白质相互作用网络（PPI）（红色：log2FC>0；蓝色：log2FC<0）。富集分析表明，这些蛋白质网络在翻译和核糖体形成中具有假定的相关性，部分是在应激条件下。
图5
图5
(A类)不同WM细胞系与NHEM细胞系LBR表达的RNA序列分析（单向方差分析和随后的Tukey多重比较试验）。(B类)原发性黑色素瘤与黑色素细胞痣LBR表达的RNA序列分析（单向方差分析和随后的Tukey多重比较试验）。(C类)NHEMs和各种黑色素瘤细胞系LBR蛋白表达的Western blot分析（Student’st吨-测试）。(D类)分别用siLBR和siCtrl对转染72h的MEL-JUSO中LBR表达进行免疫荧光染色。用DAPI（蓝色）染色的细胞核中LBR表达的典型示例（红色）。比例尺等于20µm。(E类)分别用siLBR和siCtrl转染黑色素瘤细胞系MEL-JUSO 72小时。对染色质缩合（DAPI）进行了分析和量化（Student’st吨-测试）。放大后的图像显示带有蓝色箭头标记的典型染色质病灶。比例尺等于20µm。(F类)在MEL-JUSO中分别使用β-actin作为管家（Student’st吨-测试）。条形代表平均值±SEM（*=第页≤0.05，ns=不显著）。
图6
图6
(A类)用siLBR和siCtrl转染72小时的MEL-JUSO的β-Gal染色作为衰老检测（Student’st吨-测试）。(B类)免疫荧光染色法检测经siLBR和siCtrl处理72h的MEL-JUSO中早幼粒细胞白血病蛋白（PML）的表达，作为衰老检测（Student’st吨-测试）。(C类)用荧光染料碘化丙啶流式细胞术进行细胞周期染色。用siLBR和siCtrl处理MEL-JUSO 72小时（学生的t吨-测试）。(D类)利用模拟和BRAF建立衰老模型，用qRT-PCR分析LBR的表达V600E型与对照组相比，慢病毒转导的NHEMs以及用细胞抑制药物足叶乙甙处理的MEL-JUSO细胞（Student’st吨-测试）。(E类)Epiquik染色质可及性试验，以验证用mock和Braf处理的NHEM的染色质状态V600E型（建立衰老模型），并在siLBR长期处理的MEL-JUSO中与siCtrl进行比较。将siCtrl 72 h和siCtrl LTT的log10%FE标准化，以排除更长时间内siCtrl转染过程的影响。(F类)长期转染siLBR的MEL-JUSO的Beta-Gal染色作为衰老检测（Student’st吨-测试）。(G公司)显示转染siLBR 72 h的MEL-JUSOβ-Gal阳性染色与长期转染的比率。在siLBR 72 h和siLBR LTT（学生的t吨-测试）。(H（H）)分别用siLBR和siCtrl长期转染黑色素瘤细胞系MEL-JUSO三个月。对染色质缩合（DAPI）进行了分析和量化（Student’st吨-测试）。放大后的图像显示有代表性的染色质病灶和用蓝色箭头标记的可见SAHF。比例尺等于20µm。条形代表平均值±SEM（*=第页≤ 0.05).
图7
图7
(A类)差分表达的热图。第页<0.1）基因(B类)富集图（FDR<25%）显示了运行富集分数（绿色）和富集基因集位置的剖面，以及GSEA确定的分别用siLBR和siCtrl处理的MM细胞中差异表达的基因的秩序列表。图的左侧以红色显示了siLBR MM细胞中上调的基因，右侧以蓝色显示了下调的基因。(C类)使用siLBR与siCtrl差异表达基因列表发现的最大PPI集群（红色：log2FC>0；蓝色：log2FC<0）。聚集蛋白的丰富功能主要与翻译、蛋白质定位、核糖体形成和细胞周期控制有关。
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赠款和资金

本研究由Wilhelm Sander基金会资助（2018.113.2至A.K.B.）。