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.2022年4月21日；13(4):393.
doi:10.1038/s41419-022-04755-3。

VDAC1通过线粒体非依赖性途径调节视网膜创伤后神经元细胞的丢失

埃里卡·德索萨 # 1, 玛丽亚·伊内斯·莫维奥 # 1, 利马-瓦斯康塞莱斯的恩里克 1, 加布里埃利·博维·多斯·桑托斯 1, 塔利塔·多斯·桑托斯·戈麦斯 1, 莱斯·高田·沃尔特 1, 丹妮拉·阿尔梅达·达席尔瓦 2, 蒂亚戈·罗德里格斯 三, 吉赛尔·塞奇亚罗 2, 亚历山德拉·平原纪原（Alexandre Hiroaki Kihara） 4
附属公司

VDAC1通过线粒体非依赖性途径调节视网膜创伤后神经元细胞的丢失

埃里卡·德索萨等。 细胞死亡病. .

摘要

电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）最初被描述为一种线粒体孔蛋白，调节代谢物和离子的流量，从而整合细胞生存和死亡信号。在神经系统中，VDAC1的功能作用仍不清楚。在此，采用大鼠视网膜研究VDAC1。首先，我们观察到，即使VDAC1水平的细微变化也会影响神经元的存活，导致视网膜形态的严重改变。接下来我们研究了外伤性视网膜损伤后VDAC1的调节。机械创伤后，SOD1向细胞核移位，根据蛋白质羰基化的评估，这不足以控制氧化应激的后果。使用原代视网膜细胞培养中的氧化应激和机械损伤的体外模型，可以确定4'-二异硫氰酸-2,2'-二磺酸二苯乙烯（DIDS）抑制VDAC1齐聚可以拯救细胞活力，影响小胶质细胞活化。接下来我们重点研究视网膜机械损伤后VDAC1的调节。VDAC1在损伤后2 h迅速在质膜和内质网而不是线粒体上调，损伤后VDAC1多聚体聚集。DIDS眼内应用可减少细胞凋亡并防止小胶质细胞极化，这证实了体外观察结果。考虑到小胶质细胞在神经炎症中的作用，对细胞因子的多重评估表明，DIDS的应用破坏了损伤后2 h的炎症反应，与VDAC1的快速调节相匹配。综上所述，数据显示VDAC1的精细调节影响神经元存活，创伤后的药物抑制具有神经保护作用。这种保护可能归因于对VDAC1在质膜中异常积聚的影响，从而控制小胶质细胞的激活。我们得出结论，VDAC1是神经元疾病的一个假定治疗靶点，因为它整合了死亡和存活细胞信号。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）的敲除导致视网膜的形态学改变和细胞死亡，这可能与对特定视网膜细胞亚型的影响有关。
(A类)干扰吗啉（+）和VDAC1寡核苷酸反义吗啉（−）干预后的VDAC1蛋白水平。蛋白质印迹实验中VDAC1和氨基黑（AB）的代表性谱带，以及标准化VDAC1光密度（OD）的量化(n个 = 6). 横截面的代表性图像(B类)加扰MO和(C类)VDAC1 MO处理的视网膜用苏木精和伊红染色。白色箭头表示外核层（ONL）中的玫瑰花结形成。天打乱MO和VDAC1 MO处理后的外丛状层（OPL）和内丛状层的厚度(n个 = 5). 横截面的代表性图像(E类)加扰MO和(F类)VDAC1 MO处理的视网膜用TUNEL染色（红色），用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）复染。G公司视网膜核层TUNEL阳性细胞的定量(n个 = 5).H（H）Western blot实验中裂解caspase-3和AB的代表性条带以及标准化裂解caspase-3 OD的定量(n个 = 8).我–J型打乱MO和VDAC1 MO处理的视网膜中的超氧化物歧化酶1（SOD1）蛋白免疫荧光（IF，绿色）。K（K）争夺型MO和VDAC1型MO视网膜的光受体片段（PS）和外核层（ONL）标记率(n个 = 4). （五十） VDAC1击倒实验中SOD1的Pearson相关分析。Up：western blot实验中SOD1的代表性条带；向下：显示实验1（实验1，绿色）和实验2（实验2，蓝色）中SOD1和VDAC1的OD的相关图。皮尔逊系数第页和对价值(n个 = 8） 如图所示。M（M）,N个打乱MO和VDAC1 MO处理的视网膜中的钙结合蛋白（CB）免疫荧光（IF，绿色），高倍放大OPL[65]和内核层（INL，向下）中的选定区域。O（运行）处理后CB阳性细胞的定量(n个 = 5).P（P）,问用高倍放大INL和IPL中选定区域的打乱MO和VDAC1 MO处理的视网膜中的PKC-α（PKCα）IF（绿色）。R（右）治疗后PKCα阳性细胞的定量(n个 = 5).S公司–T型打乱MO和VDAC1 MO中的Brn3a IF（绿色）处理视网膜，高倍放大神经节细胞层（GCL）中的选定区域。U型治疗后Brn3a阳性细胞的定量(n个 = 5). 数据表示为平均值±平均值标准误差。比例尺：25μm*P（P） < 0.05（成对学生）T型-测试(A类,G公司,H（H）,O（运行）,R（右）,U型)或双向方差分析，然后是Sidak的事后分析(天).
图2
图2。机械损伤导致SOD1核移位增加蛋白质羰基化。
视网膜超氧化物歧化酶1（SOD1）蛋白免疫荧光（IF，绿色）2小时(A类)和24小时(B类)损伤后，用4-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）进行复染，高倍放大感光节段。箭头指示段中的SOD1标签。(C类)根据病变距离绘制标准化SOD1强度图，病变后2小时（棕色）和24小时（红色）。虚线表示对数趋势线(n个 = 5).天SOD1的代表性IF和对照组和受损视网膜中的相应像素轮廓。垂直箭头表示像素轮廓的分析区域。白色箭头表示核SOD1标签。E类SOD1和DAPI相关性的Manders系数分析。2D直方图显示Ctl、2和24 h的相关性，y轴：DAPI[66]和x个-轴：SOD1（绿色）。ONL、INL和GCL层SOD1/DAPI的Manders系数分析(n个 = 4). (F类)损伤后2小时和24小时蛋白质羰基化和脂质过氧化(n个 = 3). 数据表示为平均值±平均值标准误差。比例尺：50μm*P（P） < 0.05和**P（P） < 单向方差分析中0.01(F类)和双向方差分析(E类)然后是Sidak的后测试。这些层显示了外光感受器节段（OS）、内光感受者节段（IS）、外核层（ONL）、外丛状层（OPL）、内核层（INL）、内网状层（IPL）和神经节细胞层（GCL）的大致定位。
图3
图3。VDAC1抑制剂4,4′-二异硫氰基-2,2′-二苯乙烯二磺酸（DIDS）对体外氧化应激模型的影响。
A类实验总体方案，显示治疗时间和具体条件。B类H后用PBS（红色）或DIDS（25µM，蓝色）处理的混合原代细胞培养物的活力2O（运行）2用MTT分析评估的暴露（50和100µM）。阴性对照（视为100%的活性）用黑色条表示(n个 = 6–10).C类经PBS（红色）或DIDS（25µM，蓝色）处理的纯神经元原代细胞培养物在H2O（运行）2用MTT评估的暴露（50和100µM）。阴性对照（100%存活率）用背杆表示(n个 = 6–8).天50µM H后PBS和DIDS处理中DAPI+核的定量2O（运行）2（左）和100µM H2O（运行）2（右）(n个 = 9).E类表示静息状态（向上，用蓝色箭头表示）和活动状态（向下，红色）小胶质细胞的典型图示。PBS中的Iba1 IF（绿色）(F类,H（H）)和DIDS(G公司,我)治疗，均为50(F类,G公司)和100µM(H（H）,我)第页，共页2O（运行）2每个图像中的数字华丽表示所指示的细胞。小胶质细胞分支的代表性图形，显示每个细胞的标准化Iba1终点(J型)以及每个单元的过程长度平均值(K（K）). 这两个图都表示n个 = 11–17（L）考虑小胶质细胞缺陷的Iba1异质性图(n个 = 153–169). Iba1+细胞分布的量化，考虑Iba1密度(M（M）,n个 = 153–169）和电池数量(N个,n个 = 11–15).O（运行）表示静止（向上，用蓝色箭头表示）和活动（向下，红色）星形胶质细胞状态的代表性图示[67]。PBS中的GFAP IF（绿色）(P（P）,R（右）)和DIDS(问,S公司)治疗，均为50(P（P）,问)和100µM(R（右）,S公司)第页，共页2O（运行）2每个图像中的数字华丽表示所指示的细胞。星形胶质细胞分支的代表性图形，显示每个细胞的标准化GFAP终点(T型)以及每个单元的过程长度平均值(U型). 在这两张图中n个 = 9-14.量化GFAP细胞分布和形态，考虑GFAP+细胞总数(V（V）,n个 = 24–32），GFAP标记，显示纤维样形态(W公司,n个 = 24–32）和GFAP+细胞面积(X（X）,n个 = 16–25). IF切片用4-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）复染。DIV：体外天数*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; ****P（P） < 0.0001，如1-所示(B类–C类,L（左）–M（M）,V（V）–W公司)或双向方差分析(天,J型–K（K）,N个,T型–U型,X（X）)其次是Sidak的post-hoc，MTT分析除外，其中使用了Fisher的LSD post-hog。这些插图是使用BioRender和Photoshop软件获得的。
图4
图4。VDAC1抑制剂4,4′-二异硫氰酸-2,2′-二苯乙烯二磺酸（DIDS）对体外机械损伤模型的影响。
A类体外七天后细胞单层的机械划痕示意图（DIV 7）。B类划痕实验中PBS和DIDS处理中的活细胞成像。虚线表示划伤区域的界限。C类用PBS（红色）或DIDS处理的划痕损伤区域的量化[66](n个 = 3).天刮伤病灶中心或周围后，PBS和DIDS治疗中4-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞核数量的量化(n个 = 8，和对 < 0.05).E类,F类病变中心经PBS或DIDS治疗后用DAPI[66]复染的Iba1免疫荧光（IF，绿色）代表性图像(E类1–F类1)或其外围(E类2–F类2)划痕后。箭头表示杆状双极小胶质细胞，箭头表示阿米巴样细胞。小胶质细胞分支的量化，显示每个细胞的归一化端点数(G公司)以及每个单元的过程长度平均值(H（H）). 在这两张图中，n个 = 8-9.考虑小胶质细胞腔隙的Iba1异质性量化(我,n个 = 12–25）和分形维数(J型,n个 = 12–25). Iba1阳性细胞相关参数的量化，如密度(K（K）,n个 ≥ 12–25）和面积(L（左）,n个 ≥ 12–25). （M-N）GFAP IF（绿色）的代表性图像，用DAPI[66]在病灶中心进行PBS或DIDS治疗(M（M）1–N个1)或其外围(M（M）2–N个2)划痕后。星形胶质细胞分支的量化，显示每个细胞的标准化GFAP终点(O（运行）,n个 = 8–11）和每个单元的过程长度平均值(P（P）,n个≥ 8–118). GFAP特征作为GFAP细胞总数的代表图(问,n个 = 19–20），纤维样形态GFAP细胞(R（右）,n个 = 19-20），GFAP细胞面积(S公司,n个 = 20–50）和GFAP标记强度(T型,n个 = 8–11). *P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; ****P（P） < 单向方差分析0.0001，然后是Sidak的事后分析。这些插图是使用BioRender和Photoshop软件获得的。
图5
图5。视网膜机械损伤后电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）的调节。
VDAC1蛋白水平的Western blot分析A类2小时，B类6小时，C类24小时，3天(天)、和7天(E类)损伤后。核糖体L26蛋白用作内部对照。横断切片中具有代表性的VDAC1免疫荧光（IF，绿色）F类控制，G公司2小时，以及H（H）病变后6h，用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）复染。箭头表示病变的中心，而头箭头表示病变后VDAC1的积聚。我左图：线粒体（Mit）、质膜（PM）和内质网（ER）中COX IV、ERp44和ZO-1蛋白的细胞分裂分析验证。右：机械创伤后根据VDAC1水平显示细胞器。J型损伤后2 h用0.03%、0.05%和0.07%多聚甲醛（PFA）浓度对VDAC1进行交联分析，其中可以识别单体（i）、二聚体（ii）和其他低聚物（iii和iv）。K（K）对照组和损伤后2 h线粒体、质膜和内质网中的VDAC1蛋白。亚细胞分馏实验的归一化光密度（OD）图。比例尺：50μm。考虑的所有分析n个 = 6和*P（P） < 0.05（成对学生）t吨-测试。ONL外核层、OPL外丛状层、INL内核层、IPL内丛状层和GCL神经节细胞层。这些插图是使用BioRender软件创建的。
图6
图6。使用4,4′-二异硫氰基-2,2′-二苯乙烯二磺酸（DIDS）对电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）的体内药理学抑制可减弱碘化丙啶（PI）在病变附近区域的扩散。
PI染色(A类)PBS-和(B类)DIDS在损伤后2小时处理视网膜。C类由ImageJ软件生成的PBS和DIDS处理视网膜中分析区域的代表性图像，以及显示较低（黑色/蓝色）到较高（黄色/白色）信号强度的相应标尺。天积分信号强度是与病灶径向距离的函数。(E类)积分信号强度是距离病灶径向距离对数的函数。F类从五参数逻辑（5PL）曲线拟合获得的治疗后的最小信号强度(n个 = 6–10).G公司通过5PL曲线拟合获得治疗后的最大信号强度(n个 = 6–10).H（H）通过5PL曲线拟合获得的山坡坡度(n个 = 6–10).我与病灶焦点的距离，其中积分信号强度对应于从5PL曲线拟合获得的拐点(n个 = 6–10).J型通过5PL曲线拟合获得对称性(n个 = 6–10). *P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01（学生）T型-测试。比例尺：100μm。
图7
图7。使用4,4′-二异硫氰酸-2,2′-二苯乙烯二磺酸（DIDS）药物抑制电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）对视网膜损伤后细胞死亡、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）分布和神经炎症反应的影响。
TUNEL标签A类PBS-和B类DIDS在损伤后2小时处理视网膜。C类病灶中TUNEL阳性细胞的定量(n个 = 7). iNOS免疫荧光(天)PBS-和(E类)DIDS在损伤后2小时处理视网膜。(F类)病灶中心iNOS阳性细胞的定量(n个 = 7). ONL外核层、OPL外丛状层、INL内核层、IPL内丛状层和GCL神经节细胞层。比例尺：100μm。G公司损伤后2小时，PBS和DIDS处理视网膜的细胞因子热图。皮尔逊的相关值范围为−1.0[66]至1.0（红色）。H（H）损伤后2小时，PBS-（红色）和DIDS-[66]治疗视网膜的Pearson相关性分析平均值。我损伤后2 h Helper T细胞1型和2型细胞因子（Th1和Th2）的标准化平均值图。Th1型细胞因子倾向于产生持续的促炎反应，而包括白细胞介素4、5、10和13的Th2型细胞因子与促进IgE和嗜酸性粒细胞相关过程相关，从而与抗炎偏见相平衡。J型损伤后2 h PBS和DIDS处理视网膜中的Th1/Th2显性图。2小时内的所有细胞因子分析均使用n个 = 4K（K）损伤后24小时PBS和DIDS处理视网膜的细胞因子热图。L（左）病变后24小时PBS和DIDS处理视网膜的Pearson相关分析平均值。M（M）损伤24小时后Th1和Th2细胞因子的标准化平均值图。N个病变后24小时PBS和DIDS处理视网膜中的Th1/Th2显性图。24小时内的所有细胞因子分析均使用n个 = 5. **P（P） < 0.01, ***P（P）< 0.001. 所有分析均使用学生的t吨-测试。
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引用人

  • 深入了解人类EMC及其与VDAC的交互。
    李M，张C，徐Y，李S，黄C，吴杰，雷M。 李明等。 老龄化（纽约州奥尔巴尼）。2024年3月15日；16(6):5501-5525. doi:10.18632/aging.205660。Epub 2024年3月15日。 老龄化（纽约州奥尔巴尼）。2024 PMID：38517390 免费PMC文章。
  • 干细胞移植和相关治疗视网膜疾病的新观点：从基因编辑到3D生物打印。
    Bovi Dos Santos G、de Lima Vasconcellos TH、Móvio MI、Birbrair A、Del Debbio CB、Kihara AH。 Bovi Dos Santos G等人。 干细胞评论报告2024年4月；20(3):722-737. doi:10.1007/s12015-024-10689-4。Epub 2024年2月6日。 干细胞修订报告2024。 PMID：38319527 审查。

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