Colocalization Analysis of Peripheral Myelin Protein-22 and Lamin-B1 in the Schwann Cell Nuclei of Wt and TrJ Mice

doi:10.3390/biom12030456

.2022年3月16日；12(3):456.

doi:10.3390/biom12030456。

Wt和TrJ小鼠雪旺细胞核外周髓鞘蛋白-22和层粘连蛋白B1的克隆化分析

附属公司

¹乌拉圭蒙得维的亚11600，Clemente Estable生物研究所Genética部门。
²乌拉圭蒙得维的亚生物研究所Clemente Estable生物科学研究所Celular del Sistema Nervioso Periférico实验室，Proteínas y Al cidos Nucleicos部门，11600。
^三乌拉圭蒙得维的亚11600，Clemente Estable，Instituto de Investigaciones Biológica，Departmento de Neurociencias Integrativas，Laboratorio de Neurobiología Comparada。
⁴神经科学实验室，Ciencias学院，República大学，蒙得维的亚11400，乌拉圭。
⁵乌拉圭蒙得维的亚共和国大学医学院历史与胚胎部，邮编：11800。
⁶乌拉圭蒙得维的亚共和国大学电子显微镜大学，邮编11400。
⁷卡洛斯三世研究所，生物研究中心，西班牙马德里28029。
⁸索菲亚女王基金会阿尔茨海默病中心，CIEN基金会，28031马德里，西班牙。
⁹乌拉圭蒙得维的亚共和国大学Ciencias分校Sección Bioquímica，邮编11400。

采购管理信息： 35327648
预防性维修识别码： PMC8946543号
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Wt和TrJ小鼠雪旺细胞核外周髓鞘蛋白-22和层粘连蛋白B1的克隆化分析

玛丽亚·维托里亚·迪·托马索等。生物分子. 2022.

.2022年3月16日；12(3):456.

doi:10.3390/biom12030456。

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¹乌拉圭蒙得维的亚11600，Clemente Estable生物研究所Genética部门。
²乌拉圭蒙得维的亚生物研究所Clemente Estable生物科学研究所Celular del Sistema Nervioso Periférico实验室，Proteínas y Al cidos Nucleicos部门，11600。
^三乌拉圭蒙得维的亚11600，Clemente Estable，Instituto de Investigaciones Biológica，Departmento de Neurociencias Integrativas，Laboratorio de Neurobiología Comparada。
⁴乌拉圭蒙得维的亚共和大学Ciencias分校神经科学实验室，邮编11400。
⁵乌拉圭蒙得维的亚共和国大学医学院历史与胚胎部，邮编：11800。
⁶乌拉圭蒙得维的亚共和国大学电子显微镜大学，邮编11400。
⁷卡洛斯三世研究所，生物研究中心，西班牙马德里28029。
⁸索菲亚女王基金会阿尔茨海默病中心，CIEN基金会，28031马德里，西班牙。
⁹乌拉圭蒙得维的亚共和国大学Ciencias分校Sección Bioquímica，邮编11400。

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摘要

外周神经系统的髓鞘化需要雪旺细胞（SC）分化为髓鞘化表型。外周髓鞘蛋白-22（PMP22）是一种完整的膜糖蛋白，在SC中表达。最初被描述为生长抑制物特异性(气体3)基因产物，受血清饥饿上调。PMP22突变是人类遗传性周围神经病的病理学特征，包括夏科特-马里奥病（CMT）。TrJ是一种携带相同基因的杂合小鼠模型pmp22（pmp22）作为CMT1E变体的点突变。叶片基因突变与一种外周（CMT2B1）或中枢（常染色体显性白质营养不良）神经病变有关。我们探讨了PMP22和Lamin B1在坐骨神经Wt和TrJ SC核中的存在，以及PMP22与沉默异染色质（HC:DAPI标记复染）、转录活性常染色质（EC）和核板（分别为H3K4m3和Lamin B1-免疫染色）的共定位。结果表明，坐骨神经TrJ SC核数较多，SC体积小于Wt。髓鞘蛋白PMP22和Lamin B1在Wt和TrJ SC细胞核中表达，主要在外周核区表达。TrJ小鼠PMP22水平高于Wt小鼠，而Lamin B1水平低于Wt小鼠。TrJ小鼠PMP22水平高于Wt小鼠，而Lamin B1水平低于Wt小鼠。PMP22与Lamin B1和转录活性EC的共定位比沉默HC的多，Wt和TrJ基因型之间存在差异。讨论了PMP22可能的核作用以及与TrJ神经病变的关系。

关键词：拉明B1；PMP22；雪旺细胞核；颤抖-J；共定位分析。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
Wt和TrJ坐骨神经中的纤维和雪旺细胞核。(A类)：Wt和TrJ坐骨神经纤维的共焦图像。(B类–D类)：方框图，说明纤维数量和SC核在整个截面厚度和SC核体积（µm）中的分布^三)分别为Wt和TrJ。在表位检索（70%甲酸）后，使用抗PMP22（绿色）免疫染色纤维，并使用DAPI（蓝色）进行复染。在DAPI通道上测量面积和体积。方框中包含第25个百分位和第75个百分位数（50%的数据）之间的数据。中间值（第50百分位）由每个方框内的横线表示。通过Mann-Whitney检验检验Wt和TrJ之间的差异(****对-值<0.0001）。分析的全景图像数量=每个基因型20张。计算每个基因型150个SC细胞核的体积。比例尺=2µm。TrJ组的纤维和SC核数均显著大于Wt组，而TrJ组SC核体积显著小于Wt组。

图2
Wt和TrJ雪旺细胞核中的DAPI、H3K4m3和PMP22信号。(A类)：TrJ或Wt-SC核中央切片的共焦图像。在表位检索（70%甲酸）后，用抗H3K4m3（红色）抗PMP22（绿色）抗体对纤维进行免疫染色，并用DAPI（蓝色）进行复染。方框图表示DAPI和H3K4m3的平均强度值（任意单位）(B类)和PMP22(C类)在TrJ和Wt-SC核上测量的信号。包含50%数据的方框将中间值表示为其中的一条横线。Wt和TrJ之间的差异通过应用Mann-Whitney检验进行验证(****对-每个基因型150个SC细胞核的值<0.0001）。比例尺=2µm。Wt和TrJ SC核均表达PMP22。TrJ中PMP22的强度显著高于Wt。此外，TrJ中染色质的总DAPI强度相对于Wt显著升高，但TrJ中的H3K4m3常染色信号强度显著低于Wt-SC细胞核。

图3
Wt和TrJ雪旺细胞核中DAPI、H3K4m3和PMP22信号的外周与中心分布。(A类)：3D表面图，说明DAPI、H3K4m3和PMP22信号在每个Wt或TrJ SC核的中心平面上的强度（任意单位）。峰值对应于强度最大的核区域（任意单位）。用于执行3D曲面图的共焦图像显示在每个相应的3D图下方。方框图显示外围(*P（P）*)与中央(C类)的分布(B类)：DAPI(C类)：H3K4m3和(D类)：Wt和TrJ SC细胞核中的PMP22信号。这些方框包含50%的数据，并表示中位数以及25%和75%的四分位数。Wt和TrJ的外周分布与中心分布之间的差异通过应用*Mann–Whitney测试*(****对-每个基因型100个SC细胞核的值<0.0001）。比例尺=2µm。DAPI和H3K4m3染色质标记的强度在中央SC核区显著占优势，而PMP22信号在Wt和TrJ基因型的外周SC核区明显占优势。

图4
层粘连蛋白B1的强度、外周与中心层粘连肽B1的分布及其与Wt和TrJ雪旺细胞核中PMP22的关系。(A类)：3D表面图，显示每个Wt或TrJ SC核中心平面上DAPI、Lamin B1和PMP22信号（任意单位）分布的强度。峰值对应于强度最大的核区域。Wt和TrJ-Sc核的共焦图像显示在每个相应的3D图下方。(B类)：合并Lamin B1与PMP22或DAPI、Lamin B1和PMP22的图像。(C类,D类)：箱形图，分别显示Wt和TrJ SC核中的Lamin B1强度及其外围（P）和中心（C）分布。每个方框中分别表示中位数、25%和75%四分位数。应用Mann-Whitney检验验证了Wt和TrJ的外周分布与中心分布之间的差异(对-数值：***<0.001，****<0.0001），每个分析和基因型的100个SC细胞核。比例尺=2µm。层蛋白B1在TrJ核内的荧光强度低于Wt-SC核，并优先定位于外周SC核区，其中PMP22强度在Wt和TrJ小鼠中均显著盛行。

图5
施万细胞核中常染色质和异染色质的染色分析。(A类)：Wt和TrJ SC细胞核的图像显示DAPI（蓝色）、常染色H3K4m3（红色）和PMP22（绿色）信号。(B类)：分别屏蔽异色马汀（M HC）和常染色质（M EC）的图像，使用斐济的阈值工具获得。(C类)：常染色质（EC）和总染色质（TC）之间的染色。*M1级*：TC（DAPI亮信号+DAPI暗信号）中EC（H3K4m3信号）的分数，以及*平方米*：EC中TC的分数(D类)：EC（M H3K4m3）和HC（M DAPI-dark）之间的Colocalization。*M1级*：EC（M H3K4m3）在HC（M DAPI−暗）中的分数，以及*平方米*：EC中HC的分数（M DAPI-dark）（M H3K4m3）。罗和陶相关性和*M1级*和*平方米*使用斐济Coloc 2插件和Costes估算共现系数对-值>95%。条形图显示了系数的中位数和95%置信区间。比例尺=2µm。采用Mann-Whitney试验确定Wt和TrJ之间的差异(****对-每个基因型100个SC细胞核的值<0.0001）。正如预期的那样，在Wt和SC核中，EC与TC共定位，与HC反定位，这两种关系在Wt中明显强于TrJ SC核。

图6
施万细胞核中PMP22与常染色质和异染色质的显色分析。(A类)：Wt和TrJ SC细胞核的图像显示DAPI（蓝色）、常染色H3K4m3（红色）和PMP22（绿色）信号。(B类)：分别掩模异染色质（M HC）、常染色质（M EC）和PMP22（M PMP22）的图像，使用斐济的阈值工具获得(C类)：PMP22（PMP22信号）和常染色质（H3K4m3信号）之间的显色分析。*M1：*PMP22区域中常染色质的分数，以及*平方米*：常染色质中PMP22区域的分数。(D类)：PMP22（PMP22信号）和异染色质（M HC）之间的显色分析。*M1级*：PMP22区域异染色质的分数，以及*M2：*异染色质中PMP22区域的分数。(B类,C类)：通过中位数和95%置信区间表示ρ和陶相关性和*M1级*和*平方米*共现系数。对呵,陶,*M1级*和*平方米*通过以下方式获得斐济Coloc 2插件与Costes对-值>95%。条形图表示系数的中位数和95%置信区间。采用Mann-Whitney检验分析Wt和TrJ之间的差异(对-数值：每个基因型100个SC细胞核中*<0.01和***<0.0001）。比例尺=2µm。相关性和共现系数值表明，PMP22在Wt和TrJ SC核中与EC共定位，与HC共定位的程度更低。然而，在Wt中与EC有更多的共定位，而在TrJ中与HC有更多的同定位。

图7
雪旺细胞核中PMP22和层粘连蛋白B1的共定位分析。(A类)：Wt和TrJ SC核的图像显示DAPI（蓝色）、Lamin B1（棕色）和PMP22（绿色）信号(B类)：分发*rho的*和陶PMP22和Lamin B1信号之间的相关系数。(C类)：分配*M1级*（拉明B1区PMP22面积的分数）和*平方米*（PMP22中Lamin B1区域的分数）共现系数。罗,陶,*M1和M2*据估计斐济Coloc 2插件与Costes对-值>95%。分别的系数分布用条形图表示，用以说明中位数和95%置信区间。采用Mann-Whitney检验分析Wt和TrJ之间的差异(*对-每个基因型100个SC细胞核中的值=0.03、**=0.002和***=0.0001。比例尺=2µm。相关性和共现系数值表明，PMP22在Wt和TrJ SC核中与Lamin B1共定位。相关性(ρ和陶)Wt显著好于TrJ(*M1级*)TrJ SC细胞核中较少，而PMP22区域中的拉明B1部分(*平方米*)这两种基因型的SC细胞核都是相同的。

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