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.2021年10月14日；12(1):6019.
doi:10.1038/s41467-021-26296-7。

Plexin-B2通过肌动球蛋白收缩性、细胞骨架张力和粘附协调集体干细胞动力学

克里斯蒂安·朱奎拉·阿尔维斯 1, 拉斐尔·达里奥利 # 2, 乔纳森·海达克 # 三, 桑乔·康 # 1, 西奥多·汉纳 # 1, 罗伯特·维纳 4, 斯蒂芬妮·德弗伦佐 三, 特杰罗街 1, 加布里埃尔·L·古塞拉 三, 阿尔西·拉马克里希南（Aarthi Ramakrishnan） 1, 罗德里戈·阿尔夫斯·迪亚斯 5, 亚历山大·沃辛斯基 6, 桑托什·凯萨里 6, 李深 1, 埃里克·A·索比 2, 何塞·保罗·罗德里格斯（JoséPaulo Rodrigues Furtado de Mendonça） 5, 埃夫伦·阿泽洛格鲁 2 三, 邹红燕 7 8, 罗兰·弗里德尔 9 10
附属公司

Plexin-B2通过肌动球蛋白收缩性、细胞骨架张力和粘附协调集体干细胞动力学

克里斯蒂安·朱奎拉·阿尔维斯等。 国家公社. .

摘要

在形态发生过程中，细胞间协调生物力学动力学的分子机制尚不清楚。在这里，我们展示了在人类胚胎干细胞和神经原细胞多细胞发育过程中，导向受体Plexin-B2在组织肌动球蛋白网络和粘附复合体中的作用。Plexin-B2操作会影响肌动球蛋白的收缩性，导致细胞硬度和细胞骨架张力的变化，以及细胞-细胞和细胞-基质的粘附。我们描述了Plexin-B2、RAP1/2效应器的功能域，以及与ERK1/2、钙激活和YAP机械感受器的信号关联，从而在Plexin-B2介导的细胞骨架张力和干细胞生理学之间提供了一种机制联系。缺乏Plexin-B2的干细胞表现出过早的谱系承诺，平衡的Plexin B2活性水平对于维持发育中神经上皮细胞的细胞构筑完整性至关重要，就像大脑类器官中的模型一样。因此，我们的研究确立了Plexin-B2在协调细胞骨架张力和细胞-细胞/细胞-基质粘附方面的重要作用，从而巩固了集体细胞力学在调控干细胞生理学和组织形态发生方面的重要性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。Plexin-B2通过机械调节控制人胚胎干细胞集落的生长和几何形状。
一IF图像（左）显示Plexin-B2（PB2）在野生型人胚胎干细胞集落（克隆WT#1）中的表达，在PLXNB2系列KO（克隆KO#1）和过度表达（OE）hESCs分别增强。右侧，hESCs的蛋白质印迹检测Plexin-B2。箭头指向170 kD的成熟Plexin-B2带。β-actin作为负荷控制。量化，单因素方差分析，然后进行Dunnett的多重比较测试。n个 = 每组12个样本。arb.units任意单位*P（P） = 0.0231, **P（P） = 0.0034数据表示平均值±SEM。b条所示人类胚胎干细胞集落的相控图像显示出传代后类似的初始生长动力学，但在第6天，PLXNB2系列KO菌落似乎较小（所示每个WT和KO的克隆#1）。箭头指向OE菌落的尖尖轮廓。菌落大小的量化如右图所示。双向方差分析，然后进行Tukey的事后检验。对于WT菌落，n个 = 第1-6天分别为14、14、9、10、18、7；对于PLXNB2科,n个 = 19, 14, 12, 14, 29, 25; 和用于PLXNB2运行经验,n个 = 25、15、11、17、26、23个殖民地，来自三种独立的文化*P（P） = 0.0261; n.s.不重要。数据表示平均值±SEM。c（c）火山图显示了PLXNB2系列相对于WT的KO或OE hESC（截止阈值：折叠变化>2和P（P） < 0.01). 顶部DEG有标签。这个P（P）DESeq2软件包使用Wald测试计算值。d日热图显示了不同基因型条件下DEG的无监督分层聚类（DEG基因型之间的折叠变化≥2）。e（电子）DEG富集反应组术语的Geneset网络视图PLXNB2系列与WT相关的KO或OE hESCs。请注意，与细胞生物力学相关的基因通路具有高度代表性，许多生长因子信号通路，如EGF和FGF，对干细胞增殖和分化至关重要。绿色部分突出显示了DEG的三种主要富集途径。这个P（P）节点连接性值通过Mann–Whitney–Wilcoxon检验计算。
图2
图2。Plexin-B2调节人胚胎干细胞集落中的机械张力和肌动球蛋白网络。
一对人胚胎干细胞集落进行F-actin（Alexa 568卵磷脂）和pMLC2染色的IF图像显示，细胞组织、集落几何形状和肌动球蛋白网络存在差异。箭头指向WT集落中的外周肌动球球蛋白带，该带在PLXNB2系列KO或OE突变体。星号表示KO菌落中的异常细胞簇。箭头指向OE菌落的拉伸轮廓，通常与F-actin应力纤维有关。DAPI用于核染色。b条顶部的直方图显示了人胚胎干细胞集落内相邻细胞之间的距离分布（细胞核质心之间的距离）。请注意，KO或OE菌落中的细胞距离分布比WT中的更广，这反映了细胞的无组织性。底部，菌落几何形状的量化（圆度指数和稠度）。对于细胞距离直方图，Kruskal–Wallis检验和Dunn的多重比较检验，n个 = 7646个WT核，4478个PLXNB2系列KO，2964用于PLXNB2系列运行经验***P（P） < 0.0001. 对于菌落几何形状，先进行单因素方差分析，然后进行Dunnett的多重比较测试，n个 = 每组15个菌落***P（P） < 0.0001. 数据表示平均值±SEM。c（c）人胚胎干细胞集落的活细胞成像显示，Plexin-B2在细胞形态、细胞组织和用SPY555-actin探针显示的皮质F-actin方面存在依赖性差异。箭头指向WT菌落中的外周F-actin带，星号表示WT中的异常细胞簇PLXNB2系列KO集落（克隆KO#2），箭头指向拉紧的皮质F-肌动蛋白和拉伸的连接边界PLXNB2系列OE殖民地。显示了细胞形状（圆形指数）和细胞面积的高含量量化。方框图显示25–75%的分位数、最小值和最大值（胡须）以及中位数（靶心）。Kruskal–Wallis检验和Dunn的多重比较检验。对于圆形度：WT，n个 = 7878个细胞；PLXNB2系列让开，n个 = 5471，以及PLXNB2系列运行经验，n个 = 3904.对于面积：WT，n个 = 9725个细胞；PLXNB2系列让开，n个 = 5615，以及PLXNB2系列运行经验n个 = 4051. ***P（P） < 0.0001. 数据表示平均值±SEM。d日顶面板的相控图像显示了用AFM弹性成像法测量的人类胚胎干细胞集落（青色框）的区域。中间面板、并排放大的相控图像以及相应的AFM刚度热图。底部，来自弹性成像测量的代表性AFM压痕曲线（左）和hESC菌落刚度方框图（右）。方框图显示中值、25–75%的分位数以及顶部和底部5%的数据点；交叉符号表示的平均值。Kruskal–Wallis检验和Dunn的多重比较检验。数据收集自n个 = 7个WT样品，n个 = 6用于PLXNB2系列KO和n个 = 7用于PLXNB2系列运行经验**P（P） = 0.0032, ***P（P） < 0.0001.e（电子）顶部，AFM地形图像显示PLXNB2系列KO单元（箭头），但更多拉伸表面PLXNB2运行经验细胞与WT-hESCs比较。底部，每个细胞表面皱纹数量的量化。单因素方差分析（ANOVA）和邓内特（Dunnett）的多重比较测试。n个 = 每组分析40个细胞***P（P） < 0.0001. 数据表示平均值±SEM。（f）hESC自组装期间由Plexin-B2调节的细胞形态、细胞组织、肌动球蛋白网络和菌落几何形状的示意图。红线表示F-actin，绿线表示肌球蛋白。
图3
图3。Plexin-B2调节hNPC中的肌动球蛋白收缩性和细胞硬度。
一顶部，神经诱导产生hESC衍生hNPC的时间表。hNPC的底部共焦IF图像显示F-actin（指骨样蛋白）和pMLC2在PLXNB2系列KO和OE。b条方框图显示了F-actin和pMLC2强度的高含量量化，以及WT的几何结构（细胞扩散面积、圆形度和坚固度）和细胞核面积，PLXNB2系列KO和OE hNPC。方框图显示25–75%的分位数、最小值和最大值（胡须）、中位数（牛眼）和平均值（交叉符号）。对于强度和细胞几何形状：WT，n个 = 2123个细胞；PLXNB2系列让开，n个 = 930，和PLXNB2系列运行经验，n个 = 1172.对于核面积：WT，n个 = 2265个核；PLXNB2系列让开，n个 = 1275年，以及PLXNB2系列运行经验，n个 = 1720.从每组30个随机字段收集的数据。Kruskal–Wallis检验和Dunn的多重比较检验**P（P） = 0.0037和***P（P） < 0.0001.c（c）如Lifeact_mScarlet所揭示的，hNPCs的活细胞成像显示突变hNPCs中不同的F-肌动蛋白分布模式。箭头指向WT-hNPC中的皮质F-actin，在PLXNB2系列KO电池。箭头指向应力纤维PLXNB2系列OE hNPC。d日顶部的相控图像描绘了用AFM弹性成像法测量的hNPC培养区域（蓝盒子）。底部并排放大的相控图像和相应的AFM刚度热图。右，WT弹性成像测量的代表性AFM压痕曲线，PLXNB2系列KO、OE hNPC（左）和右方框图量化了单元刚度（中位数、25-75%分位数、中位数、顶部和底部5%数据点，平均值用交叉符号表示）。Kruskal–Wallis检验和Dunn的多重比较检验。数据收集自n个 = 每组3个样本**P（P） = 0.0013, ***P（P） < 0.0001.e（电子）左图为基于vinculin的FRET张力传感器（CFP和YFP蛋白通过弹性连接体连接）的示意图，用于测量焦点粘连处的张力（FA）。拉伸连接器会降低FRET信号。hNPC中归一化FRET信号的中间代表图像。注意，瞬时转染导致细胞中FRET构建体的可变表达，如CFP基线荧光所示。右侧，FRET指数的量化显示为方框图（中位数，25–75%分位数，顶部或底部5%数据点）。Kruskal–Wallis检验和Dunn的多重比较检验。从175名FA收集到的WT数据，191名FAs收集到的PLXNB2系列KO和268个FAPLXNB2系列运行经验***P（P） = 0.0001（重量vs PB2 KO）和***P（P） = 0.0008（WT与PB2 OE）。
图4
图4。Plexin-B2影响人胚胎干细胞多细胞组织中的细胞-细胞粘附。
一共聚焦IF图像显示，与WT群体中的组织模式相比，突变hESC群体中E-cadherin和ZO-1的结合招募发生了改变。右侧显示的量化数据点代表E-cadherin和ZO-1免疫强度的边界/细胞质比率。n个 = 每组30个细胞。单因素方差分析（ANOVA）和邓内特（Dunnett）的多重比较测试**P（P） = 0.0016和***P（P） < 0.0001. 红线代表平均值。b条共聚焦IF图像显示突变hESC菌落中β-catenin的重新分布。底部面板显示了方框区域的放大图像，突出了WT细胞中的β-catenin膜定位，该定位在PLXNB2系列让开。箭头指向核β-catenin增加PLXNB2系列OE单元。c（c）细胞组分的WBs显示膜相关（Mem）β-连环蛋白向细胞质（Cyto）转移PLXNB2系列KO hESCs（蓝色方框突出显示），由CRISPR抗药性Plexin-B2拯救。PLXNB2系列OE导致核（Nuc）β-catenin增加（以橙色方框突出显示）。WCL全细胞裂解物。数量显示在右侧。单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。n个 = WT为5，n个 = 4个用于PLXNB2系列让开，n个 = 5用于救援，以及n个 = 4个用于PLXNB2系列哦*P（P） = 0.0183. 数据表示平均值±SEM。d日WB和量化显示WT和PLXNB2系列突变体hESCs。β-actin作为负荷控制。arb.units任意单位。单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。n个 = 每组4个样本。数据表示平均值±SEM。e（电子）在低粘附条件下培养48小时后，漂浮3D人胚胎干细胞聚集。右侧显示了骨料的横截面积和形状（L/S比、最长与最短直径）的量化。PB2 KO克隆#1。单因素方差分析（ANOVA）和邓内特（Dunnett）的多重比较测试。对于交叉区域，n个 = WT用20个骨料，n个 = 15用于PLXNB2系列让开，n个 = 9用于救援，以及n个 = 37用于PLXNB2系列运行经验。对于L/S比，n个 = 19个WT骨料，n个 = 11代表PLXNB2系列让开，n个 = 19用于救援，以及n个 = 28用于PLXNB2系列3-5个油田的OE**P（P） = 0.0071, ***P（P） < 0.0001. 数据表示平均值±SEM。（f）图像和量化显示了PLXNB2系列与WT相比，KO-hESC聚集体能够承受移液或低速离心施加的剪切力。双面未配对t吨-测试以在组内进行比较。移液：WT，n个 = 之前和之后的5个骨料n个 = 4之后；PLXNB2系列让开，n个 = 5之前和n个 = 8之后***P（P） = 0.0008. 离心：WT，n个 = 和之前8n个 = 7之后；PLXNB2系列让开，n个 = 3骨料之前和之后n个 = 14之后***P（P） < 0.0001; n.s.不重要。数据表示平均值±SEM。克三维人胚胎干细胞集料横截面的IHC图像显示PLXNB2系列KO导致细胞紊乱和肌动球蛋白网络紊乱，而PLXNB2系列OE导致肌动球蛋白致密物增强。
图5
图5。Plexin-B2影响细胞-基质粘附并控制hESC集落的收缩性。
一,b条TIRF显微镜图像和定量显示，在PLXNB2系列突变hESC菌落(一)和hNPC(b条)与野生型（WT）细胞相比。对细胞进行FA标记paxillin和F-actin（指骨样蛋白）染色。方框区域的放大图像如下所示，为黑白颠倒，虚线勾勒出单个单元格。方框图描绘了25–75%的分位数、最小值和最大值（胡须）、中间值（中线）和平均值（交叉符号）。对于hESC:FA编号，n个 = 每组14-15个细胞。FA面积，n个 = 2271个用于WT的FA，n个 = PB2 KO为1042，以及n个 = 978用于PB2 OE。FA圆度，n个 = WT的1042个FA，n个 = PB2 KO为1042，以及n个 = 978用于PB2 OE*P（P） = 0.0397, ***P（P） < 0.0001. 对于hNPC：FA编号，n个 = 每组20个细胞。FA面积和圆度，n个 = 1829 FA用于WT，n个 = PB2 KO为2385，以及n个 = PB2 OE为4528。Kruskal–Wallis检验和Dunn的多重比较检验**P（P） = 0.0084, ***P（P） < 0.0001.c（c）分子动力学数学模拟。左侧是基于珠簧模型的仿真组件。模拟AFM探针的尖端被描绘成一个绿色球体，弹性常数为Kx个和K年分别在x和y方向。右图为模拟AFM探测器在两种不同情况下所行驶距离的力函数图。左图，当改变模拟收缩性增加的肌动蛋白膜吸引力能量时，作用力对虚拟AFM探针的响应与根据Plexin-B2活性得出的实验AFM数据的结果类似（见图2）。当改变膜-膜吸引能时（右），这种结果是看不到的。d日左，活细胞成像的实验设计。中间，当暴露于针对整合素β1（P5D2）的功能阻断抗体或同型对照IgG时，用CellMask标记的hESCs图像显示出不同的细胞形态。箭头指向细胞突起PLXNB2系列KO hESCs公司。箭头指向细胞膜起泡PLXNB2系列整合素阻断后的OE hESCs。单元格圆度（圆度指数）的量化显示在右侧。单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。对于同种IgG治疗：n个 = 100个WT电池，n个 = 80个细胞用于PB2 KO，以及n个 = PB2 OE为63。整合素β1治疗：n个 = 41个细胞用于WT，n个 = PB2 KO为54，以及n个 = PB2 OE为63个细胞**P（P） = 0.0025和***P（P） < 0.0001. 数据表示平均值±SEM。
图6
图6。Plexin-B2通过RAP1/2发出信号，以协调人胚胎干细胞集落中的细胞力学。
一顶部，Plexin-B2结构域结构：ECTO外结构域、RBD-Rho结合结构域、GAP-Ras GTPase结构域、VTDL、四个C末端氨基酸，形成PDZ结合基序。成熟Plexin-B2的切割位点用红色箭头表示。底部，表达野生型（WT）Plexin-B2或信号突变体（CRISPR-KO抗性）的慢病毒载体：GAP中的mGAP突变，RBD中的mRBD突变，VTDL的ΔVTDL缺失，ECTO结构域的ΔECTO缺失。b条相差和共聚焦图像显示了表达野生型或丛蛋白-B2信号突变体的hESC集落的细胞骨架紊乱和β-连环蛋白膜分布表型的严重程度（背景为PLXNB2系列KO）。星号表示菌落内的异常细胞簇。数量如下所示。单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。对于hESC菌落大小：n个 = 14个WT菌落，n个 = 7用于救援，n个 = dVTDL为18，n个 = mRBD为24，n个 = mGAP为21，以及n个 = dECTO为12**P（P） = 0.0028; ***P（P） < 0.0003（重量vs mRBD）***P（P） < 0.0001（重量vs mGAP）。对于其他人，n个 = 每组3-4个。对于F-actin病灶**P（P） = 0.002. 对于pMLC2病灶**P（P） = 0.0019（重量vs.mGAP）和**P（P） = 0.0037（重量vs.dECTO）。对于连接β-cat峰*P（P） = 0.025. 数据表示平均值±SEM。c（c）顶部，RAP2A激活状态的FRET探针图。WT中归一化RAP2A FRET信号的中间代表图像，PLXNB2系列KO（克隆#3），PLXNB2系列OE hESC。方框区域的放大图像如下所示。方框图显示中值、25–75%的分位数以及顶部或底部5%的数据点。Kruskal–Wallis检验和Dunn的多重比较检验。n个 = WT的98个细胞-细胞膜面积；n个 = PB2 KO为89；n个 = 85人PLXNB2系列运行经验**P（P） = 0.0013和***P（P） < 0.0001.d日共聚焦IF图像显示，与没有RAP2A表达载体的对照菌落相比，RAP2A亚型对人胚胎干细胞集落的皮质肌动球蛋白网络、集落几何形状和细胞组织的影响。箭头指向WT群体中的外周F-actin带，星号表示WT群体的异常细胞簇PLXNB2系列KO菌落，箭头指向紧绷的皮层F-actin和伸展的连接边界PLXNB2系列OE殖民地。注意组成活性（CA）RAP2AV12版本表型复制Plexin-B2 KO（克隆#3），而显性阴性（DN）RAP2AN17号现象复制Plexin-B2 OE。每个菌落肌动球蛋白聚集灶的数量和细胞边界处pMLC2的长度如下所示。对于聚集焦点：控制，n个 = 4个WT菌落，n个 = PB2 KO为4，以及n个 = PB2 OE为8；加利福尼亚州RAP2AV12版本,n个 = WT为9，n个 = PB2 KO为5，以及n个 = PB2 OE为7；DN RAP2A管道N17号,n个 = WT为9，n个 = PB2 KO为8，以及n个 = PB2 OE为6*P（P） = 0.010, **P（P） = 0.0017, ***P（P） < 0.0001. 对于pMLC2：控制，n个 = 每个基因型80–100个细胞边界；加利福尼亚州RAP2AV12版本,n个 = 每个基因型60–70；DN RAP2A管道N17号，重量，n个 = 每个基因型50-90***P（P） < 0.0001. 单因素方差分析（ANOVA），然后邓内特（Dunnett）进行事后校正，以与WT组进行比较。双面未成对t吨-在比较两组（括号）的数据时进行了测试。数据表示平均值±SEM。
图7
图7。Plexin-B2参与YAP机械传导途径并激活ERK1/2和钙信号。
一共聚焦IF图像显示PLXNB2系列KO hESCs，但在PLXNB2系列OE与标准细胞培养基上的WT细胞进行比较（涂有Matrigel的玻璃盖玻片）。所有基因型组的水凝胶培养物硬度较软（1和5 kPa）相似，核YAP/TAZ显著降低。定量显示细胞核YAP/TAZ信号大于、等于或小于细胞质信号的细胞的相对分数（N>C，N=C，N<C）。双向方差分析，然后进行Dunnett的事后检验，以与WT进行比较。n个 = 每种情况下115–301个细胞**P（P） = 0.0019, ***P（P） = 0.0001（WT玻璃vs KO和OE玻璃）***P（P） = 0.0002（WT玻璃vs WT 1 kPa）***P（P） = 0.0004（WT玻璃vs KO 1 kPa）***P（P） = 0.0008（WT玻璃vs WT 5 kPa）***P（P） = 0.0009（WT玻璃vs KO 5 kPa）***P（P） = 0.0001（WT玻璃vs OE 5 kPa）。双面未成对t吨-在比较两组（括号）的数据时进行了测试***P（P） = 0.0002（OE玻璃vs OE 1 kPa，OE玻璃vs OE 5 kPa），数据表示平均值±SEM。b条WB和量化显示PLXNB2系列OE单元与WT或PLXNB2系列KO hESCs公司。箭头指向成熟的Plexin-B2带。β-actin作为负荷控制。arb.units任意单位。单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。n个 = 每组3个样本**P（P） = 0.0017. 数据表示平均值±SEM。c（c）顶部，WB显示Dox诱导的Plexin-B2（iPLXNB2）单位为hESCs。GAPDH起到了装载控制的作用。qRT-PCR数据的底部热图说明了YAP1公司及其靶基因CYR61、CTGF和ANKRD1Plexin-B2诱导后。热图由n个 = 3种独立的文化。d日IF图像显示RAP2A亚型对人胚胎干细胞集落中YAP/TAZ细胞核/细胞质定位的影响。注意，本构活性RAP2A的表达V12版本导致所有三组的细胞质YAP/TAZ升高，表现为Plexin-B2 KO。量化显示细胞核YAP/TAZ免疫信号大于、等于或小于细胞质信号的细胞的相对分数（N>C，N=C，N<C）。双向方差分析，然后进行Dunnett的事后检验，以与WT组进行比较。为了控制，n个 = 每个基因型330–466个细胞；用于CA RAP2AV12版本,n个 = 每个基因型163-233个；用于DN RAP2AN17号,n个 = 每个基因型412-543个*P（P） = 0.040和***P（P） < 0.0001. 双面未成对t吨-在比较两组（括号）的数据时进行了测试*P（P） = 0.015, **P（P） = 0.0012. 数据表示平均值±SEM。e（电子）,（f）活体细胞成像显示Dox诱导YAP1表达的人胚胎干细胞中皮质F-actin（由LifeAct_mScarle可视化）的差异5SA公司(e（电子）)或YAP1 shRNA(（f）). 箭头指向紧绷的皮层F-actin和伸展的细胞边界。数据表示平均值±SEM。使用Tukey的事后检验进行单向方差分析。对于YAP15SA公司：重量，n个 = 54–80个细胞；pb2ko，n个 = 33–50个单元格**P（P） = 0.0053和***P（P） < 0.0001. 对于YAP1 shRNA:WT，n个 = 62–89个细胞；PB2运行经验，n个 = 每个细胞100个*P（P） = 0.012和***P（P） < 0.0001. n.s.不重要。数据表示平均值±SEM。克针对在PLXNB2系列与WT相关的KO或OE hESCs。注意Plexin-B2 OE细胞中ERK/MAPK和钙信号的激活增强。按调整后的类别进行排名P（P）通过IPA的Fisher精确检验计算的值。小时WBs显示ERK1/2磷酸化（p-ERK1/2）增加PLXNB2系列OE细胞与WT.p-ERK1/2相比，DN RAP2A进一步增加N17号在所有三组（WT、PB2 KO和PB2 OE）中均有表达。相反，CA RAP2AV12版本表达导致p-ERK1/2减少PLXNB2系列OE单元。ERK1/2用作加载控制。arb.units任意单位。单因素方差分析（ANOVA），然后邓内特（Dunnett）进行事后校正，以与WT组进行比较。双面未成对t吨-在比较两组（括号）的数据时进行了测试。n个 = 每组3个样本*P（P） = 0.017（WT与PB2 OE）*P（P） = 0.028（控制PB2 OE与CA RAP2AV12版本PB2 OE）*P（P） = 0.0024（控制PB2 OE与DN RAP2AN17号PB2 OE）***P（P） < 0.0001. 数据表示平均值±SEM。我与中心区域相比，Fluo-3-AM染料的钙成像显示在集落边缘的hESCs中细胞内钙水平更高。钙信号在PLXNB2系列运行经验。Kruskal–Wallis检验和Dunn的多重比较检验。对于菌落边缘，n个 = WT、PB2 KO和PB2 OE分别为328、332和116。对于菌落中心，n个 = WT、PB2 KO和PB2 OE分别为1000、648和417个单元***P（P） < 0.0001. 橙色线表示中值，蓝色线表示25%和75%的百分位数。
图8
图8。Plexin-B2影响干细胞分化和神经上皮结构。
一IF图像和量化显示PAX6的小块+Plexin-B2缺乏的人胚胎干细胞集落中的细胞（箭头所示）。单向方差分析，然后是Tukey的事后检验。n个 = 每组6个菌落*P（P） = 0.019. 数据表示平均值±SEM。b条qRT-PCR结果证实了Plexin-B2缺陷hESCs相对于WT的分化标记基因的诱导PLXNB2系列在KO细胞中表达。双面未配对t吨-测试。n个 = 每组8个样本**P（P） = 0.0036（用于GSC公司), **P（P） = 0.0015 (DES公司)、和***P（P） = 0.0002 (PLXNB2系列). n.s.不重要。数据表示平均值±SEM。c（c）IF图像显示以SOX2为代价的β-III微管蛋白表达增加PLXNB2系列KO hNPC来源于hESCs（克隆KO#2）。定量显示神经突起长度增加（通过β-III微管蛋白IF显示）PLXNB2系列KO电池与WT或PLXNB2系列OE单元。单向方差分析，然后是Tukey与WT的多重比较测试。n个 = 每组4个随机字段**P（P） = 0.0014. 对，qRT-PCR结果显示SOX2标准和管B3在里面PLXNB2系列KO和OE hNPC相对于WT。单向方差分析，然后是Tukey与WT的多重比较测试。n个 = 每组3个样本**P（P） = 0.0048; ***P（P） < 0.0001. 数据表示平均值±SEM。d日WBs显示依赖Plexin-B2的hNPC中的总YAP和pYAP水平。β-actin作为负荷控制。arb.units任意单位。单因素方差分析（ANOVA）和邓内特（Dunnett）的多重比较测试。n个 = 每组3个样本。对于YAP**P（P） = 0.0026. 对于pYAP**P（P） = 0.0085. 数据表示平均值±SEM。e（电子）人类胚胎干细胞脑类器官衍生的时间轴。图像显示，在匹配的时间点（第42天），相对于WT，具有Plexin-B2扰动的脑类器官尺寸较小。（f）IHC图像显示SOX2+神经递质和DCX+野生型脑类器官中位于心室结构中的神经母细胞，但在突变体中处于混乱状态。放大后的图像如下所示，括号标记心室区（VZ）厚度，如右侧条形图所示。单向方差分析，然后是Tukey与WT的多重比较测试。n个 = WT、KO和OE分别为17、10、14个心室区*P（P） = 0.042（重量vs.KO）和*P（P） = 0.047（WT与OE）。数据表示平均值±SEM。克Plexin-B2信号传导与机械调节和干细胞功能的链接模型。
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