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.2021年1月至6月：296:100176。
doi:10.1074/jbc。RA120.015996。 Epub 2020年12月17日。

甲基化赖氨酸特异性抗体识别抗原的结构基础

石井三崎 1, 中木真一（Makoto Nakakido） 2, 何塞·M·卡瓦韦罗 三, 黑田大辅 4, C J大村 5, 丸山俊之（Toshiaki Maruyama） 5, 凯文·恩茨明格 5, 津本洋平 6
附属公司

甲基化赖氨酸特异性抗体识别抗原的结构基础

石井美明等。 生物化学杂志. 2021年1月-6月.

摘要

蛋白质受到包括甲基化在内的多种翻译后修饰的调节。尽管它很重要，但质谱分析发现的大多数蛋白质甲基化修饰在功能上没有特征，部分原因是难以获得可靠的甲基位点特异性抗体。为了阐明功能性甲基位点特异性抗体如何识别抗原，并导致开发一种新的方法来创建此类抗体，我们使用免疫文库与噬菌体展示配对来创建识别MAP3K2的三甲基Lys260作为代表性底物的兔单克隆抗体。我们分离出几个甲基位点特异性抗体，其中包含独特的互补性决定区域序列。我们使用结构和生物物理分析表征了每种抗体的抗原识别模式，揭示了分子细节，例如与甲基化/非甲基化抗原的结合亲和力以及负责识别甲基化赖氨酸残基的结构基序，每个抗体通过其识别靶抗原。此外，与Western blotting分析结果的比较表明，一种关键的抗原识别模式可以产生与抗体的蛋白质和肽抗原的交叉反应。计算模拟有效地重现了我们的生物物理数据，捕获了不同亲和力和特异性的抗体。我们详尽的表征提供了功能性甲基位点特异性抗体的分子结构，因此有助于开发通过从头设计生成功能性甲基部位特异性抗体。

关键词：抗体；抗原识别；生物物理；晶体结构；蛋白质甲基化。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突作者使用了CJ发明的专利技术WizAmp（美国9890414）。O.和T.M.用于抗体采集。

数字

图1
图1
使用兔免疫法获得甲基化特异性抗体，然后进行基于噬菌体展示的选择。A类，甲基化赖氨酸在MAP3K2基因中具有结构域结构的位置。甲基化位点被认为位于一个大的非结构化区域的中间。B类、用于免疫的甲基化肽的氨基酸序列和每个实验。C类，抗体采集示意图。对家兔进行免疫接种，构建Fab噬菌体展示文库。进行了四轮生物筛选以扩增抗原特异性Fab。D类，基于序列的聚类结果。每个圆圈表示一个独特的Fab克隆。每个簇中的克隆数显示在每个簇的中间或侧面。E类，所选克隆CDR环的氨基酸序列。
图2
图2
Fab肽结合的表面等离子体共振（SPR）分析。A类，每个克隆对甲基化和非甲基化肽的SPR响应曲线。B类，Fab亲和力图。垂直轴和水平轴分别表示每个Fab克隆对甲基化和非甲基化肽的亲和力。与对角线垂直距离最远的克隆具有最高的肽特异性。C类，通过对Fab克隆与含有K5三甲基化的组蛋白H4肽之间相互作用的SPR分析得出的亲和力曲线。C9和D6表现出可检测的结合亲和力。
图3
图3
蛋白质印迹分析。A类，确认MAP3K2和SMYD2的表达。将HA-标记的MAP3K2和FLAG-标记的SMYD3或模拟表达载体共转染HEK293细胞的细胞裂解物用SDS-PAGE分离，印迹到膜上，并用抗HA、抗FLAG标记或抗β-肌动蛋白抗体染色。B类，使用每个IgG进行western blotting。用每个IgG对膜进行染色，然后用HRP结合的抗兔IgG抗体孵育。F9和E6缺乏与蛋白抗原结合产生的清晰带信号，而C9和D6只有在SMYD3存在时才表现出强结合。C类，使用MAP3K2 K260A突变体进行western blotting。突变显著减少了相应的带。
图4
图4
Fab肽复合物的晶体结构。A类，显示了每个Fab的肽结合区域的概述。重链和轻链都有颜色绿色和青色分别为；C9结构与其他Fab的方向不同。强调了肽中的甲基化赖氨酸残基红色F9和E6显示了一种结合模式，其中甲基化赖氨酸指向轻链，而甲基化赖胺酸则深埋在C9和D6的链间界面。B类，显示了聚焦于甲基化赖氨酸残基和周围芳香笼的放大视图。甲基化赖氨酸残基(红色)被芳香族残留物困住(黄色的)在每个Fab结构中。
图5
图5
Fab.的MD模拟分析。A类，根据每个Fab克隆的模拟时间绘制每个模拟中甲基化赖氨酸NZ原子的RMSD值。F9表现出高度的动态可变性，而C9、E6和D6在模拟过程中有效地捕获了肽；在甲基化赖氨酸残基被抛出的时间点，F9复合物的结构与图重叠。B类根据模拟时间绘制了抗原肽存在（holo）或不存在（apo）时C9和D6中芳香笼的RMSD值。在C9和D6载脂蛋白结构中观察到的RMSD的增加可能表明芳香笼的崩溃。
图6
图6
抗体改进和设计。A类，所有Fab结构都是重叠的，突出显示的芳香残基组成芳香笼。图中显示了芳香笼的相对位置。B类，甲基化赖氨酸的放大视图(红色)在F9和E6的复杂结构中。组成芳香笼的残留物(黄色的)和天冬氨酸残留(蓝色)位于E6中芳香笼附近的突出显示。
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参考文献

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