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.2021年2月1日；40（3）：e105819。
doi:10.15252/embj.2020105819。 Epub 2020年12月10日。

层粘连蛋白B1的下降是年龄相关性成年海马神经发生缺失的基础

特蕾西·A·贝多西 1 2, 朱迪思·霍特曼 三, 胡安·塞巴斯蒂安·埃吉古伦 三, 赛义德·加塞姆扎德 1, 妮可·伦德 三, 妮可·M·诺瓦雷斯 1, 劳伦·胡 1, 莎拉·帕里拉克 1, 艾哈迈特·登利 1, 林恩·伦道夫·穆尔 1, Takashi Namba公司 4 5, 弗雷德·H·盖奇 1, Tomohisa Toda先生 1 三 6
附属公司

层粘连蛋白B1的下降是年龄相关性成年海马神经发生缺失的基础

特蕾西·A·贝多西等。 浮雕J. .

摘要

成年海马体的神经发生随着年龄的增长而下降，这一过程与认知和情绪损伤有关。然而，这种下降背后的机制仍然难以捉摸。在此，我们表明，成人神经干/祖细胞（ANSPC）中的核层粘连蛋白之一的层粘连B1的年龄依赖性下调是成人海马神经发生中年龄相关改变的基础。我们的结果表明，ANSPC中较高水平的层粘连蛋白B1可防止过早分化，并调节ANSPC的维持。然而，ANSPC中的层粘连蛋白B1水平在衰老过程中下降。ANSPC中早熟缺失的层粘连蛋白B1暂时促进神经发生，但最终耗尽。此外，ANSPC中层粘连肽B1的减少再现了小鼠与年龄相关的焦虑样行为。我们的结果表明，层粘连蛋白B1的下降是干细胞衰老的基础，并影响成人神经发生和情绪调节的体内平衡。

关键词：成年海马神经发生；层粘连蛋白B1；情绪调节；干细胞老化。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明他们没有利益冲突。

数字

图1
图1。层粘连蛋白B1在ANSPC中的富集

  1. DG的SGZ中层粘连蛋白B1的富集。

  2. 层粘连B1高细胞的免疫组织化学分析。层粘连B1高细胞表达Sox2或PSA‐NCAM，但不表达Prox1。箭头表示SGZ中Prox1阴性层粘连B1高细胞。

  3. pNestin‐GFP小鼠层粘连蛋白B1的免疫组织化学分析。开放箭头表示RGL‐ANSC，闭合箭头表示非RGL（NR）‐NPC。

  4. 成人海马神经发生期间层粘连蛋白B1水平变化的模式。

  5. 诱导分化4天后，对NPC和Tuj1+分化神经元的层粘连B1进行免疫细胞化学。

  6. 的相对表达式最小1和管道3通过qRT–PCR从NPC和在指定天数分化的神经元中揭示***P（P） < 0.001, **P（P） < 0.01, *P（P）<0.05，一个样本t吨‐测试(n个 = 4).

  7. 不同神经细胞类型中层粘连蛋白B1免疫反应信号强度的量化。 F类 3,82 = 173.1,P（P）=1.2秒‐34,n个=每种细胞类型12–30个细胞，单因素方差分析，然后进行Tukey–Kramer检验(**P（P） < 0.01).

数据信息：A.U.=任意单位。条形图显示平均值±SEM。比例尺，75µm in（A），25µm in.（B下部，C），10µm英寸（B上部，E）。
图2
图2。ANSPC中层粘连蛋白B1的年龄依赖性降低
  1. A类

    SGZ中层粘连蛋白B1的年龄依赖性降低。早在5.5个月大时，SGZ中的层粘连蛋白B1水平就显著降低。插图显示SGZ中放大倍数较高的图像。

  2. B–D类

    使用免疫荧光信号定量层粘连蛋白B1水平。Sox2阳性和PSA‐NCAM阴性的ANSPC中的Lamin B1水平在5.5个月大时选择性下调（ANPCs，P（P）=1.02129e‐19；成神经细胞，P（P）=0.09，DGC，P（P） = 6.4011e‐15号，方差分析）**P（P）<0.001，方差分析，然后进行Tukey–Kramer检验。（3只动物，每种条件30个细胞）

  3. E类

    RGL‐ANSC（上部）和NR‐ANPC（下部）的层粘连蛋白B1从2个月龄到5.5个月龄的年龄依赖性降低。箭头表示RGL‐ANSC或NR‐ANPC。

  4. F类

    RGL‐ANSC和ANPC中层粘连蛋白B1水平的量化*P（P） < 0.05, ***P（P）<0.001，（4只动物，每种条件下有18-32个细胞，Mann-Whitney检验）。

  5. G公司

    一个假设模型。衰老诱导ANSPC中层粘连蛋白B1的减少，这是干细胞衰老的基础。

数据信息：比例尺，100µm in（A），10µm in.（E）。条形图显示平均值±SEM。A.U.=任意单位。
图EV1
图EV1。生成和评估最小1条件敲除小鼠系
  1. A类

    以下内容的示意图最小1条件敲除鼠标线（cKO）。

  2. B类

    在DG的SGZ给药TAM后10天，在ANSCP中诱导EYFP。

  3. C、 D类

    层粘连B1完整缺失细胞（箭头）和非EYFP ANPC（开放箭头）的代表性图像（C）、层粘连B1-部分丢失细胞（箭头。

  4. E类

    TAM给药10天或3周后，每种细胞类型的层粘连B1缺乏的EYFP+细胞分数（计数细胞总数，10天；RGL‐ANSCs.81细胞，ANPC=116细胞，成神经细胞=74细胞，来自3只动物；3周，RGL‐的ANSCs=39细胞，ANPC=59细胞，成神经元=84细胞，来自三只动物）。层粘连蛋白B1缺陷细胞被定义为与相同类型对照细胞的平均强度相比，层粘连蛋白质B1强度降低30%或更多。

  5. F类

    输注TAM后10天Ki67+增殖细胞（箭头）中层粘连B1缺陷的共焦图像。开放箭头表示无Ki67的层粘连B1缺陷细胞。

  6. G公司

    Ki67+增殖细胞中层粘连B1缺陷细胞的比例。Ki67+非RGL细胞（其他细胞）表现出层粘连蛋白B1缺乏，而只有少数Ki67+RGL‐ANSC表现出层黏连蛋白B1缺陷，这意味着细胞增殖有必要耗尽层粘连蛋白质B1（计数的细胞总数，10天；RGL-ANSC。115个细胞，非RGL cells=196个细胞，来自3只动物；3周；RGL‐ANSC。42个细胞，非RGL细胞=142个细胞，来自3只动物）。

数据信息：比例尺，200µm in（B，左），50µm in.（B，右），10µm（C，D，F）。
图3
图3。ANSPC中层粘连蛋白B1的早熟降低导致焦虑样行为
  1. A类

    TAM治疗和行为测试示意图。

  2. B–F类

    开场（OF）测试。（B） 野外测试中勘探路径的彩色编码分布。正方形的X‐Y轴对应于of竞技场。老WT小鼠和最小1‐cKO小鼠在of竞技场的外围花费更多时间。（C） OF测试期间行驶的总距离。各组间无显著差异。F类 2,25 = 2.23,P（P）=0.13，方差分析。（D） of测试期间的移动速度。F类 2,25 = 1.60,P（P）=0.22，方差分析。N.S.（不显著）。（E） 在外围花费的时间的分数。F类 2, 25 = 10.71,P（P）=0.00044，方差分析，然后是Tukey–Kramer**P（P） < 0.01. （F） 周边行驶距离的分数，F类 2, 25 = 3.84,P（P）=0.035，方差分析，然后是Tukey–Kramer*P（P） < 0.05 (n个：对于OF测试，WT=10，WT‐old=7，Lmnb1‐cKO=11）。

  3. G公司

    of测试行为的主成分分析(n个：对于OF测试，WT=10，WT‐old=7，Lmnb1‐cKO=11）。圆圈表示每组66%的置信水平。

  4. H–J型

    新颖-抑制喂食。（H） NSF测试期间的总喂食时间，P（P）=0.0068，Kruskal–Wallis检验，然后是Dunn检验**P（P） < 0.01. (n个：重量=6，旧重量=7，最小1‐cKO=6，用于新奇抑制馈电）。（一） NSF测试期间的食物消耗，P（P）=0.014，Kruskal–Wallis检验，然后是Dunn检验*P（P） < 0.05. （J） NSF测试期间的馈送实例总数。N.S.（不显著）。

数据信息：条形图显示平均值±SEM。
图EV2
图EV2。Lmnb1‐cKO小鼠年龄相关行为增加

  1. OF测试期间的重新排列计数。F类 2,25 = 3.95, *P（P）=0.032，方差分析，然后是Tukey–Kramer(n个：对于OF测试，WT=10，WT‐old=7，Lmnb1‐cKO=11）。

  2. 花在刻板行为上的平均时间。F类 2, 25)= 7.15,P（P）=0.0035，方差分析，然后是Tukey–Kramer*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01 (n个：对于OF测试，WT=10，WT‐old=7，Lmnb1‐cKO=11）。

  3. OF中的总休息时间。F类( 2, 25)= 4.65,P（P）=0.018，方差分析，然后是Tukey–Kramer*P（P） < 0.05 (n个：对于OF测试，WT=10，WT‐old=7，Lmnb1‐cKO=11）。

  4. 外围区域的总休息时间。F类 2,25 = 12.34,P（P）=0.00019，方差分析，然后是Tukey–Kramer**P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001 (n个：对于OF测试，WT=10，WT‐old=7，Lmnb1‐cKO=11）。

  5. 中心和外围区域之间的休息时间比率。Kruskal–Wallis测试，然后是Dunn测试*P（P） < 0.015, **P（P） < 0.01 (n个：对于OF测试，WT=10，WT‐old=7，Lmnb1‐cKO=11）。

  6. Y迷宫测试中自发交替无明显变化。F类 2,25 = 0.12,P（P）=0.89，方差分析(n个：WT=10，WT‐old=7，Lmnb1‐cKO=11）。

  7. 三组之间对新颖物体的偏好没有差异F类 2,25 = 3.39,P（P）=0.45，方差分析）(n个：对于OF测试，WT=10，WT‐old=7，Lmnb1‐cKO=11）。

  8. NSF测试中24小时禁食后的成比例体重减轻F类 2,25 = 6.11,P（P）=0.94，方差分析）(n个：WT=6，WT‐旧=7，Lmnb1‐cKO=6）。

  9. NSF测试中的喂料延迟。Kruskal–Wallis测试，然后是Steel测试*P（P） = 0.038, (n个：重量=6，旧重量=7，最小1‐cKO=6）。

数据信息：数据以平均值±SEM表示。
图4
图4。拉明B1基因敲除促进ANPC的短期分化
  1. A类

    TAM治疗和脑组织采集示意图。

  2. B、 C类

    TAM治疗3周后，对照组和cKO的EYFP和DCX染色代表性图像。注意，DCX阳性细胞的数量增加。方框表示（C）中的放大区域。

  3. D–F型

    TAM治疗3周后进行量化。在EYFP阳性细胞中，RGL‐ANSC的密度没有差异(P（P） = 0.65,t吨测试）（D）。ANPC密度显著降低(P（P） = 0.0037,t吨‐test）（E），而DCX阳性细胞的密度显著增加(P（P） = 0.014,t吨测试）（F）。(n个=4代表控制，n个=3（对于cKO）。打开的箭头表示各自的单元格。

  4. G–I型

    KO诱导两个月后的量化(n个=3代表控制，n个=4（对于cKO）。RGL‐ANSC的密度没有显著差异(P（P） = 0.29,t吨测试）（G）。ANPC的密度显著降低。(P（P） = 0.0092,t吨测试）（H）。神经母细胞的密度没有显著差异(P（P） = 0.76,t吨测试）（I）。

  5. J–L型

    TAM治疗3周后增殖细胞的定量。Ki67+RGL‐ANSC的密度显著降低(P（P）=0.027，Mann–Whitney检验）（J）和Ki67+ANPC也显著降低。(P（P） = 0.034,t吨‐测试）（K）。Ki67+神经母细胞密度显著增加(P（P） = 0.0011,t吨测试）（N）(n个=4代表控制，n个=4（对于cKO）（L）。

  6. M–O型

    TAM治疗两个月后增殖细胞的定量。Ki67+RGL‐ANSC的密度显著降低(P（P） = 0.0086,t吨Ki67+ANPC和Ki67+成神经细胞密度也显著降低。(P（P） = 0.023,P（P） = 0.025,t吨‐测试）(n个=3代表控制，n个=3（对于cKO）（N，O）。

  7. P（P）

    拒绝返回RGL‐ANSC。左图，实验方案。在注射BrdU后3周进行分析。中间是BrdU+GFAP+RGL‐ANSC的代表性图像。右，BrdU+GFAP+RGL‐ANSC的量化(P（P） = 0.019,n个=4代表控制，n个=4（对于cKO）。

数据信息：数据表示为平均值±SEM。比例尺，100µm in（B），25µm in.（C，P）和10µm英寸（D，F，H）*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001,t吨‐测试。可在线获取此图的源数据。
图EV3
图EV3。层粘连蛋白B1缺失对成年海马神经发生的影响
  1. A类

    BrdU治疗和脑组织收集示意图。

  2. B类

    TAM给药3周后DG中BrdU染色的代表性图像。cKO小鼠中BrdU阳性细胞显著增加。

  3. C类

    TAM给药3周后BrdU+细胞的定量(*P（P） = 0.021,t吨‐测试，n个 = 4).

  4. D类

    TAM给药2个月后BrdU+细胞的定量(***P（P） = 0.0007,t吨‐测试，n个=3代表控制，4代表cKO）。

  5. E、 F类

    共聚焦图像的正交视图，用于识别EFYP+细胞的细胞类型。

  6. G公司

    EdU治疗和脑组织采集示意图。

  7. H（H）

    DG中EdU‐click染色的代表性图像。cKO小鼠的EdU阳性细胞明显减少。

  8. 我

    DG中EdU阳性细胞的量化表明，与Cont-15M小鼠类似，层粘连B1的缺失会显著减少DG中的新细胞生成**P（P）<0.01，方差分析(P（P）=0.0009），然后进行Tukey–Kramer测试(n个=每个基因型4个）。

数据信息：数据表示为平均值±标准偏差。比例尺、100µm in（B）、50µm in.（E，F）和200µm英寸（H）。
图5
图5。拉明B1基因敲除长期消耗成人神经发生
  1. A类

    TAM治疗和脑组织采集示意图。

  2. B、 C类

    使用TAM治疗6.5个月后SGZ的典型共焦图像。

  3. D–I型

    KO诱导6.5个月后细胞数量的量化(n个=4（对于Cont‐8M），n个=3（对于cKO‐8M），n个=4（对于Cont‐15M）。（D） RGL‐ANSC的密度在cKO中趋于降低。F类 2,8 = 3.98,P（P）=0.063，单向方差分析。（E） cKO-8M和Cont-15M小鼠的ANPC密度降低。F类 2,8 = 11.49,P（P）=0.0044，单向方差分析，然后进行Tukey的HSD检验(**P（P） < 0.01). （F） 在WT年龄和cKO小鼠中，DCX阳性细胞的密度降低。P（P）=0.0091，Kruskal–Wallis检验，然后是Dunn检验(*P（P） < 0.05). （G） cKO‐8M小鼠中Ki67+RGL‐ANSC的密度降低(*P（P）=0.029，Kruskal‐Wallis检验，然后是Dunn检验）。（H） 三组间Ki67+ANPC密度无显著差异(P（P）=0.49，Kruskal–Wallis检验）。（一） cKO-8M小鼠的NeuN+EYFP+神经元密度降低。 F类 2,8 = 34.85,P（P）=0.00011，单向方差分析，然后是Tukey的HSD测试(**P（P） < 0.001). (n个=4（对于Cont‐8M），n个=3（对于cKO‐8M），n个=4（对于Cont‐15M）。

数据信息：数据表示平均值±SEM。比例尺，100微米英寸（B），50微米英寸（C）。
图EV4
图EV4。层蛋白B1对成人出生细胞的存活至关重要
  1. A类

    TAM给药2个月后EYFP+NeuN+神经元的量化*P（P） = 0.042,t吨‐测试，n个 = 4).

  2. B类

    BrdU治疗和脑组织采集示意图。

  3. C类

    TAM治疗10天或2个月后BrdU染色的代表性图像。比例尺=250µm。

  4. D类

    每个时间点BrdU阳性细胞的定量。第10天，BrdU阳性细胞的数量显著增加(*P（P） = 0.049,t吨‐测试）或3周(*P（P） = 0.019,t吨‐试验）在cKO小鼠TAM后，但不在2个月时(P（P） = 0.12,t吨‐测试，n个=3只动物）。数据代表平均值±标准差。

  5. E类

    TAM治疗后10天至2个月BrdU+细胞的存活率(*P（P） = 0.015,t吨‐测试，n个 = 3). 数据表示平均值±标准偏差。

  6. F类

    TAM治疗2个月后活性半胱天冬酶的典型图像。比例尺=20µm。

  7. G–I型

    TAM治疗2个月后，活性半胱天冬酶3的密度存在显著差异，但在TAM治疗3周或6.5个月后（3周，P（P） = 0.86,n个 = 3,t吨‐测试；2个月*P（P） = 0.028,n个 = 5‐6,t吨‐测试；6.5个月，P（P） = 0.09,n个=4，方差分析）。数据表示为平均值±标准偏差。

  8. J型

    实验模式。RV:pSox2‐Cre‐GFP注射到最小1fl/fl:Ai3或最小1+/+：在21dpi时评估Ai3小鼠和EYFP+新生神经元的形态。比例尺=20µm。

  9. K（K）

    WT和cKO小鼠RV标记神经元的树突状重建。比例尺=20µm。

  10. 五十、 M（M）

    量化树突总长度（L）和分支总数（M）（对照组65个细胞，每个基因型3只动物的cKO 35个细胞；总长度*P（P） = 0.0147; 分支数量，P（P）=0.099，Mann–Whitney试验）。数据表示为平均值±SEM。

  11. N个

    轴突长度的Sholl分析**P（P） < 0.01, *P（P） < 0.05 (t吨‐试验）（对照组65个细胞，每个基因型3只动物的cKO 35个细胞）。数据表示为平均值±SEM。

图6
图6。NPC中的层粘连蛋白B1依赖性基因调控
  1. A类

    的示意图最小1NPC中的KO。在引入LV后，NPC通过FGF2和EGF保持在增殖状态。

  2. B类

    对照组和对照组差异表达基因的MA图最小1‐KO NPC。

  3. C、 D类

    LaminB1调节基因的基因本体分析。

  4. E类

    LaminB1基因调控方向的分数。基因的分配取决于LaminB1与基因相互作用的位置。红色条表示上调基因，蓝色条表示层粘连蛋白B1敲除后下调基因。

  5. F类

    NPC中的层粘连蛋白B1定向基因示例。蓝色条表示laminB1‐LAD。

图EV5
图EV5。核蛋白细胞中层粘连蛋白B1调控的基因通路
  1. A类

    左心室交付后确认层粘连蛋白B1耗竭；pSox2‐创建。闭合的白色箭头表示右面板中的层粘连B1免疫反应性消失。比例尺=25µm。

  2. B、 C类

    差异表达基因的GO和KEGG途径富集分析。

  3. D、 E类

    针对层粘连蛋白B1定向上调基因的GO和KEGG富集分析。

  4. F类

    折叠更改表达式英国标准普尔4和同上1-4来自cKO-NPC的转录组分析，n个=3，DEseq2用于统计检验。数据表示为平均值±SEM。

  5. G公司

    qRT-PCR验证Bmp4型和识别码4cKO-NPC的上调(英国标准普尔4, *P（P） = 0.022;识别码4, *P（P）=0.015，一个样本t吨‐测试，n个 = 3). 数据以平均值±标准差表示。

图7
图7。层粘连蛋白B1的外源性表达抑制神经分化
  1. A类

    实验模式。在增殖状态下将RV导入NPC后，取出FGF2 2天，并采集样本。

  2. B、 C类

    通过qRT-PCR证实拉明B1过度表达(*P（P） = 0.020,n个=3，一个样本t吨‐试验）和NPC的免疫细胞化学。比例尺=10µm。

  3. D类

    退出FGF2后诱导分化标记物的相对表达。0%表示与控件的表达级别相同。层粘连蛋白B1的外源表达抑制神经分化相关基因的诱导(Tuj1号机组, *P（P） = 0.023;探头1, ***P（P） = 0.00012;神经D1，**P（P） = 0.0046;Ascl1公司, ***P（P） = 0.00064;S100β, ***P（P） = 0.000097;n个=3，一个样本t吨‐测试）。

  4. E类

    实验模式。RV:EGFP‐IRES‐EGFP或LaminB1‐IRES-EGFP注射到野生型小鼠的DG中，7天后收集大脑。

  5. F类

    伴RV的EGFP+细胞外源性表达层粘连B1后的共焦图像；LaminB1-IRES-GFP（LaminB1-OE.）比例尺=20µm。

  6. G、 H（H）

    层粘连蛋白B1的外源性表达抑制神经元分化体内箭头表示DCX+GFP+细胞在对照组（G，左），开放箭头表示层B1‐OE细胞中的Sox2+GFP+cells。层粘连蛋白B1过度表达显著降低了EGFP+DCX+细胞的比例(***P（P） < 0.0002,n个=3），而EGFP+DCX+Sox2+细胞和EGFP+Sox2+细胞的比例增加（EGFP+DC X+Sox2+**P（P） = 0.0024; EGFP+Sox2+，P（P） = 0.058; 其他*P（P） = 0.02). 比例尺=20µm。

数据信息：数据表示平均值±SD。
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