MEKK2 mediates aberrant ERK activation in neurofibromatosis type I

doi:10.1038/s41467-020-19555-6

.2020年11月11日；11(1):5704.

doi:10.1038/s41467-020-19555-6。

MEKK2介导I型神经纤维瘤病ERK异常激活

附属公司

¹美国纽约州纽约市威尔康奈尔医学院病理和实验医学系，邮编：10065。
²乐高化学生物科学公司研究中心，韩国大田，34302。
^三厦门大学医学院细胞应激生物学国家重点实验室，福建厦门361102。
⁴美国北卡罗来纳州达勒姆市北卡罗莱纳中央大学生物制造研究所和技术企业（BRITE）药物科学系，邮编27707。
⁵上海交通大学医学院上海免疫研究所免疫学与微生物学系、细胞死亡与分化教育部重点实验室，200025，中国上海。
⁶耶鲁大学免疫代谢研究所，上海交通大学医学院，200025，中国上海。
⁷马萨诸塞大学医学院医学系风湿病科，马萨诸塞州伍斯特市种植园街364号，邮编：01605，美国。
⁸美国纽约州纽约市威尔康奈尔医学院病理和实验医学系，邮编：10065。mag3003@med.cornell.edu。

PMID： 33177525
预防性维修识别码： PMC7658220型
DOI（操作界面）： 10.1038/s41467-020-19555-6

MEKK2介导I型神经纤维瘤病ERK异常激活

Seoyeon Bok公司等。国家公社. 2020.

.2020年11月11日；11(1):5704.

doi:10.1038/s41467-020-19555-6。

附属公司

¹美国纽约州纽约市威尔康奈尔医学院病理和实验医学系，邮编：10065。
²乐高化学生物科学公司研究中心，韩国大田，34302。
^三厦门大学医学院细胞应激生物学国家重点实验室，福建厦门361102。
⁴美国北卡罗来纳州达勒姆市北卡罗莱纳中央大学生物制造研究所和技术企业（BRITE）药物科学系，邮编27707。
⁵上海交通大学医学院上海免疫研究所免疫学与微生物学系、细胞死亡与分化教育部重点实验室，200025，中国上海。
⁶耶鲁大学免疫代谢研究所，上海交通大学医学院，200025，中国上海。
⁷马萨诸塞大学医学院医学系风湿病科，马萨诸塞州伍斯特市种植园街364号，邮编：01605，美国。
⁸美国纽约州纽约市威尔康奈尔医学院病理和实验医学系，邮编：10065。mag3003@med.cornell.edu。

PMID： 33177525
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摘要

I型神经纤维瘤病（NF1）的特征是由NF1缺失引起的显著骨骼表现。虽然ERK激活激酶MEK1/2抑制剂有望作为治疗NF1的手段，但该策略产生的ERK通路的广泛阻断可能与限制毒性的治疗相关。在这里，我们寻找了能够更窄范围地抑制骨骼中NF1缺失下游ERK激活的靶点，发现MEKK2是成骨细胞中非经典ERK通路的一个新成分，在NF1缺失后介导异常ERK激活。因此，尽管小鼠成熟成骨细胞（Nf1）中Nf1有条件缺失^{飞行/飞行};Dmp1-Cre）和Mekk2^-/-每个显示骨骼缺陷，Nf1^{飞行/飞行};Mekk2公司^-/-;Dmp1-Cre小鼠表现出NF1相关表型的改善。我们还提供了FDA批准的具有抗MEKK2活性的抑制剂可以改善NF1骨骼病理学的基本证据。因此，MEKK2在成骨细胞ERK通路中发挥MAP3K的作用，为NF1的治疗提供了一种潜在的新的治疗策略。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图1。MAP3K MEKK2参与了NF1缺失时ERK的异常激活。**
一通过免疫印迹法评估从*Mekk2公司*^+/+和*Mekk2型*^−/−老鼠。用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。b条主要*Mekk2公司*^+/+和*Mekk2公司*^−/−COB被OSE1-Luc（ATF4）报告子转染(n个 = 3个生物独立的样品）。平均值±标准误差，未配对，双尾学生t吨测试：***P（P）* < 0.01.c（c）纯化的未激活GST-MEK1或His-MEK2与纯化的GST-MEKK2孵育，并进行体外激酶分析。如方法部分所述，使用了两种带有匕首和双匕首标记的重组GST标记的MEKK2。GST-MEK5作为阳性对照。d日来自三个独立实验的代表性印迹。主要*1号机组*^{飞行/飞行}感染载体（Vec）或Cre慢病毒的COB在分化条件下培养7天。通过免疫印迹分析NF1、磷酸化ERK1/2和ERK1/2的水平。**e（电子）**16周龄股骨p-ERK（红色）免疫染色的代表性图像*1号机组*^{飞行/飞行}和*1号机组*^{飞行/飞行};*Dmp1-Cre公司*老鼠。白色箭头表示p-ERK阳性的成骨细胞。细胞核用DAPI（蓝色）复染，标尺显示100µm。每只小鼠检查三个独立的字段(n个 = 每组3只小鼠）。**（f）**人类MSCs（hMSCs）感染了表达对照（shCtrl）的shRNA慢病毒或*NF1型*（shNF1）靶向shRNAs并用FGF2（25 ng/ml）刺激指定时间，然后通过phos-tag电泳分析MEKK2磷酸化。克通过phos-tag电泳或用p-MEKK2抗体免疫印迹分析MEKK_2磷酸化*1号机组*^{飞行/飞行}感染vec或Cre慢病毒的成骨细胞在分化条件下培养14天。所有的印迹均通过至少三个独立重复得到证实。小时对16周龄的股骨进行p-MEKK2免疫组织化学*1号机组*^{飞行/飞行}和*1号机组*^{飞行/飞行};*Dmp1-Cre公司*老鼠。比例尺表示100µm。每只小鼠检查三个独立的字段(n个 = 每组3只小鼠）。我hMSCs感染指示的shRNA慢病毒，然后在免疫印迹前用FGF2刺激指示的时间，并通过免疫印迹分析ERK1/2的激活。除非另有说明，否则所示的所有数据均代表至少两个独立实验。补充图5中提供了所有未处理的斑点。源数据作为源数据文件提供。

**图2。MEKK2缺乏可部分逆转小鼠与NF1相关的骨骼病理。**
一16周龄的股骨*1号机组*^{飞行/飞行},*1号机组*^{飞行/飞行};*Mekk2公司*^−/−,*1号机组*^{飞行/飞行};*Dmp1-Cre公司*、和*1号机组*^{飞行/飞行};*Mekk2公司*^−/−;*Dmp1乘员*小鼠进行μCT分析。b条定量参数为16周龄时的多孔体积、孔隙率（多孔体积/总体积）和多孔表面*1号机组*^{飞行/飞行}(n个 = 5),*1号机组*^{飞行/飞行};*Mekk2公司*^−/−(n个 = 8),*1号机组*^{飞行/飞行};*Dmp1-Cre公司*(n个 = 8），以及*1号机组*^{飞行/飞行};*Mekk2公司*^−/−;*Dmp1-Cre公司*(n个 = 10）老鼠。平均值±标准差，采用Tukey多重比较测试的单向方差分析。**c（c）**股骨远端干骺端小梁骨的典型μCT三维重建图像。d日定量参数包括16周龄的骨小梁体积/总体积（BV/TV）、厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）和间距（Tb.sp）*1号机组*^{飞行/飞行}(n个 = 8),*1号机组*^{飞行/飞行};*Mekk2公司*^−/−(n个 = 6),*1号机组*^{飞行/飞行};*Dmp1-Cre公司*(n个 = 9）、和*1号机组*^{飞行/飞行};*Mekk2公司*^−/−;*Dmp1-Cre公司*(n个 = 8）老鼠。平均值±标准差，采用Tukey多重比较试验进行单因素方差分析。**e（电子）**16周时小鼠颅骨的μCT扫描*1号机组*^{飞行/飞行},*1号机组*^{飞行/飞行};*Mekk2公司*^−/−,*1号机组*^{飞行/飞行};*Dmp1-Cre公司*、和*1号机组*^{飞行/飞行};*Mekk2公司*^−/−;*Dmp1-Cre公司*老鼠。**（f）**16周龄小鼠的P1NP、CTX、FGF23、PTH、25（OH）维生素D和磷酸盐的血清水平。数据用方框图表示，中间线表示中值，方框表示中值的95%置信区间，胡须表示范围。每个点代表一个单独的鼠标。克16周龄儿童小梁（左侧面板）和皮质骨（右侧面板）中p-MEKK2（绿色）、p-MEK1（洋红色）和p-ERK（红色）的代表性图像和免疫染色定量*1号机组*^{飞行/飞行},*1号机组*^{飞行/飞行};*Dmp1-Cre公司*、和*1号机组*^{飞行/飞行};*Mekk2型*^−/−;*Dmp1-Cre公司*老鼠。细胞核用DAPI（蓝色）复染，标尺指示100µm。每只小鼠检查三个独立的字段(n个 = 每组3只小鼠）。平均值±标准差，Tukey多重比较检验的单因素方差分析**P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01; ****P（P）* < 0.001; *****P（P）* < 0.0001.

**图3。MEKK2的药理抑制抑制ERK激活。**
一原发性COB通过感染表达SV40大T抗原的逆转录病毒而永生化。用指示的抑制剂预处理COB（1µM，30分钟），然后在30分钟后用或不用FGF2（25 ng/ml，20分钟）刺激COB。通过phos-tag电泳分析MEKK2磷酸化。b条通过phos-tag电泳或免疫印迹法分析MEKK2磷酸化，并在原代培养基中加入抗p-MEKK_21号机组^{飞行/飞行}感染vec或Cre慢病毒的成骨细胞，使用指示的抑制剂和FGF2刺激。**c（c）**用指示的抑制剂处理hMSCs，然后通过phos-tag电泳检测MEKK2磷酸化。d日在抑制剂治疗后，对WT永生化COB进行裂解和免疫印迹，以检测指示的抗体。**e（电子）**与指示的抑制剂孵育并用或不用FGF2刺激后，在Saos-2细胞中检测到ERK激活。**（f）**纯化的未激活GST-MEK1与纯化的GST-MEKK2和指定剂量的波纳替尼孵育，并通过体外激酶试验分析MEKK_2的激酶活性。克原代成骨细胞基因的表达水平*1号机组*^{飞行/飞行}感染vec或Cre慢病毒的成骨细胞。感染后，用指示的抑制剂或*Mekk2公司*-靶向shRNA并培养14天(n个 = 4个生物独立样本）。平均值±标准差。小时用二甲基亚砜、波纳替尼（1µM）、BRITE-0600690（BRITE-690，非活性化合物）和BRITE-0700719（BRITE-719，活性化合物）处理Saos-2细胞1小时，有或没有FGF2刺激。用免疫印迹法检测ERK1/2的磷酸化水平。所有显示的数据都代表了两个或三个完全独立的实验。补充图5中提供了所有未处理的斑点。源数据作为源数据文件提供。

**图4。抑制MEKK2可改善骨骼NF1小鼠模型的骨骼缺陷。**
一16周龄的股骨*1号机组*^{飞行/飞行}用载体治疗的小鼠(n个 = 4）或波纳替尼(n个 = 5）和*1号机组*^{飞行/飞行};*Dmp1-Cre公司*用载体治疗的小鼠(n个 = 7）或波那替尼(n个 = 6） μCT分析。b条定量参数包括多孔体积、孔隙率（多孔体积/总体积）和来自载体（veh）和波那替尼处理组（pon）的多孔表面*1号机组*^{飞行/飞行}*;Dmp1-Cre公司*老鼠。平均值±标准差，采用Tukey多重比较测试的单向方差分析。**c（c）**股骨远端干骺端小梁骨的典型μCT三维重建图像。d日车内小梁BV/TV、厚度（Tb.Th）、小梁数（Tb.N）和间距（Tb.sp）的相对定量分析(n个 = 8）和波那替尼治疗(n个 = 7）第组，共组*1号机组*^{飞行/飞行}*;Dmp1-Cre公司*平均值±标准差，未配对，双尾学生t吨测试。**e（电子）**16周龄小鼠颅骨的μCT扫描*1号机组*^{飞行/飞行}和*1号机组*^{飞行/飞行}*;Dmp1-Cre公司*用载体或波那替尼治疗的小鼠。**（f）**16周龄婴儿血清PINP、25（OH）维生素D和磷酸盐水平*1号机组*^{飞行/飞行}和*1号机组*^{飞行/飞行}*;Dmp1-Cre公司*用veh或ponatinib治疗的小鼠。数据用方框图表示，中间线表示中值，方框表示中值的95%置信区间，胡须表示范围。每个点代表一个单独的鼠标。克16周龄股骨中p-MEKK2（绿色）、p-MEK1（洋红色）和p-ERK（红色）的代表性免疫荧光图像和定量*1号机组*^{飞行/飞行}（重量）和*1号机组*^{飞行/飞行}*;Dmp1-Cre公司*用载体或波那替尼治疗的小鼠。最右侧的图像显示了橙色虚线框的放大视图。白色箭头表示信号阳性的成骨细胞。细胞核用DAPI（蓝色）复染，标尺指示100µm。每只小鼠检查三个独立的字段(n个 = 每组3只小鼠）。平均值±标准差，采用Tukey多重比较测试的单向方差分析**P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01; ****P（P）* < 0.001; *****P（P）* < 0.0001. 源数据作为源数据文件提供。

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