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.2022年4月；13(4):258-280.
doi:10.1007/s13238-0200-00794-8。 Epub 2020年11月5日。

核外周染色质-层粘连B1相互作用是人类细胞染色质结构和动力学的整体完整性所必需的

Lei Chang（雷昌） # 1 2, 李梦凡 # 三 4, 石鹏邵 # 1, 陈丽 5, 鄯善艾 5, 薛伯欣 1, 侯英平 三 4, 张艺文 1, 李瑞峰 三 4, 范晓英 2, 何爱斌 三 5, 程莉 6 7, 孙玉洁 8
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核外周染色质-层粘连B1相互作用是人类细胞染色质结构和动力学的整体完整性所必需的

Lei Chang（雷昌）等。 蛋白质细胞. 2022年4月.

摘要

真核生物基因组折叠成高阶构象，伴随着协调基因组功能的约束动力学。然而，这些分层组织的三维（3D）染色质结构和动力学背后的分子机制尚不清楚。通过结合成像和测序，我们研究了层粘连蛋白B1在染色质结构和动力学中的作用。我们发现，层粘连蛋白B1的缺失导致层粘连结构域（lamina-associated domains，LAD）从核外周脱落，并伴随着整体染色质的重新分布和失活。因此，细胞间和细胞间相互作用增加，但拓扑关联域（TAD）的结构不受影响。通过活细胞基因组位点追踪，我们进一步证明了层粘连蛋白B1的缺失导致染色质动力学增加，这是由于染色质分解和向核质重新分布所致。综上所述，我们的数据表明，核外周的层粘连蛋白B1和染色质相互作用促进了LAD的维持、染色质的致密化、基因组划分到染色体区域和A/B区并限制染色质动力学，支持了它们在染色质高阶结构和染色质动力学中的关键作用。

关键词：三维基因组；A/B隔间；高碳化合物；染色质动力学；染色体区域；层粘连蛋白B1；活细胞成像；超分辨率成像。

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数字

图1
图1
层粘连蛋白B1调节染色质亚核定位和整体致密化。（A） H3K27me3的免疫染色。红色：H3K27me3。绿色：层粘连蛋白B1。蓝色：DAPI染色。显示了原子核的二维截面。比例尺，5µm。使用ImageJ软件测量H3K27me3和DAPI通道沿白线的荧光强度。（B） WT中每个外壳中H3K27me3的归一化荧光强度(n个=35）和层粘连蛋白B1-KO(n个=39）个单元。2个独立实验。平均值+标准偏差（SD）。P（P）<0.05，成对t吨测试。（C） H3K4me2、H3K4me3和H3K27ac的免疫染色。红色：组蛋白修饰。绿色：层粘连蛋白B1。蓝色：DAPI染色。显示核Z堆的最大强度投影。比例尺，5µm。（D） H3K4me2、H3K4me3和H3K27ac免疫染色信号的归一化总荧光强度。统计分析显示层粘连B1-KO细胞中三种组蛋白修饰水平增加***P（P）<0.001，成对t吨测试。2个独立实验。（E） 2号和18号染色体的代表性三维投影和三维重建染色体绘制图像。绿色：2号染色体的FISH信号。红色：18号染色体的FISH信号。蓝色：DAPI染色。对于三维投影图像，显示核Z堆栈的最大强度投影，比例尺为5µm。三维重建图像在Imaris软件中进行处理，比例尺为2µm。（F） 基于染色体质心到核质心的相对距离对染色体核定位进行量化。这个距离用核体积的立方根来归一化。平均值±标准偏差***P（P）<0.001，Mann-Whitney试验。3个独立实验。（G） 染色体2和18相对于核体积所占体积的量化。层粘连B1-KO细胞的染色体显示出明显较大的相对体积。平均值±标准偏差***P（P）<0.001，Mann-Whitney试验。3个独立实验。（H） 2号染色体和18号染色体区域之间重叠频率的量化。WT细胞中呈现2号染色体和18号染色体区域相互作用的细胞比例明显小于层粘连B1-KO细胞***P（P）<0.001，Fisher精确检验。3个独立实验
图2
图2
LAD的维护需要Lamin B1。（A） 第14号染色体（20–107 Mb）的基因组轨迹显示了层粘连蛋白A ChIP-seq数据的log2（ChIP/input）值、由EDD识别的LAD、A（橙色，PC1阳性值）和B（蓝色，PC1阴性值）隔室、WT和层粘连素B1-KO细胞中的基因表达水平（FPKM）以及基因密度。（B） WT和层粘连B1-KO细胞中log2（ChIP/输入）值的散点图。2个独立实验。（C） LAD大小在WT和层粘连B1-KO细胞中的分布。2个独立实验。（D） WT和lamin B1-KO细胞中ciLAD、fiLAD、fLAD和cLAD基因组区域的log2（ChIP/input）值***P（P）<0.001，未配对t吨-测试
图3
图3
拉明B1缺失降低了染色体区域和A/B区的绝缘性。（A） WT和层粘连B1-KO样本中整条染色体的归一化Hi-C跨相互作用矩阵。（B） WT和层粘连B1-KO细胞中每条染色体的跨相互作用比率。对于每条染色体，跨相互作用比率是该染色体总相互作用中跨相互作用的百分比。箱线图中间的黑线表示中值，箱线图的上端和下端表示上下四分位数，胡须表示最大值和最小值***P（P）<0.001，成对t吨-测试。2个独立实验。（C） WT和层粘连B1-KO细胞中2号染色体（110–190 Mb）的归一化Hi-C相互作用矩阵，以及WT和层面粘连B1-GO细胞之间基因组区域的差异矩阵（分辨率：200 kb）。热图下方是PC1值和基因密度图。橙色代表A区，蓝色代表B区。高基因密度区域与A区相关。（D）WT和层粘连B1-KO细胞中每条染色体（X染色体除外）的细胞间相互作用（AB）和细胞内相互作用（AA+BB）比率*P（P）<0.05，成对t吨-测试。2个独立实验。（E） 基因组区域从WT细胞中的A区室过渡到层粘连蛋白B1-KO细胞中的B区室的例子。WT和层粘连B1-KO细胞第3染色体（51.5–100 Mb）上的A室（橙色，PC1阳性信号）和B室（蓝色，PC1阴性信号）分布。（F） WT和层粘连B1-KO细胞中A/B区之间基因组区域转换的全基因组摘要。2个独立实验。（G） WT和层粘连B1-KO细胞中10号染色体（60-90 Mb）的TAD模式和绝缘得分分布示例。（H） WT和层粘连B1-KO细胞中TAD边界周围的平均绝缘得分分布（±500 kb）。2个独立实验。（一） TAD长度在WT和层粘连B1-KO细胞中的分布。2个独立实验
图4
图4
拉明B1缺失改变基因组位点的位置偏好。（A） CRISPR-SunTag的示意图，这是一个标记和信号放大系统，包括融合了24个GCN4肽串联重复序列的dCas9和用于GCN4多肽的sfGFP标记单链抗体（scFv）。使用dCas9-（GCN4）24倍单个sgRNA与scFv-GCN4-sfGFP在最低水平上共表达，可以将多达24种荧光蛋白募集到靶位点。（B） 每个核被分成两个部分，核外围（蓝色）和核质（粉红色，包括核仁）。（C） CRISPR-SunTag标记WT和层粘连B1-KO细胞中的chr2-1 Mb、chr2-114 Mb、chr2-238 Mb和chr18-14 Mb。白色箭头显示每个位点的信号。比例尺，5µm。（D） chr2-1Mb的核质放大频率(n个=84），chr2-114 Mb(n个=117），chr2-238 Mb(n个=97）和chr18-14 Mb(n个=80），以及chr2-1 Mb的电池(n个=88），chr2-114 Mb(n个=97），chr2-238 Mb(n个=108）和chr18-14 Mb(n个=85）在层粘连B1-KO细胞中**P（P）< 0.01, *P（P）<0.05，未配对t吨测试。3个独立实验。（E） mCherry表达的WT细胞第2染色体1Mb位点的亚核定位变化(n个=87），mCherry表达lamin B1-depleted细胞(n个=82），层粘连B1-再悬浮细胞(n个=94）和层粘连蛋白B1（1-433）-救援细胞(n个= 90). ***P（P）<0.001，Fisher精确检验。3个独立实验
图5
图5
染色质-层粘连B1相互作用的丧失会增加染色质的流动性。（A） WT端粒的MSD曲线(n个=100）和层粘连蛋白B1-KO(n个=86）个单元。野生型2号染色体1Mb位点的MSD曲线(n个=27）和层粘连蛋白B1-KO(n个=29）个单元格。WT中18号染色体上14个Mb位点的MSD曲线(n个=28）和层粘连蛋白B1-KO(n个=33）个单元。平均值±标准误差（SE）。3个独立实验。（B） WT细胞核质、层粘连B1-KO细胞核质体和WT细胞核外周2号染色体上标记的1Mb位点的追踪轨迹。轨迹的不同颜色代表时间推移。比例尺，5µm。（C） WT中1 Mb基因座的MSD曲线（表达mCherry，n个=29），层粘连蛋白B1-KO(n个=29），层粘连蛋白B1-还原(n个=25）和层粘连蛋白B1（1-433）-救援(n个=30）个单元格。平均值±SE.3独立实验。（D） WT中1Mb基因座的扩散系数（表达mCherry，n个=29），层粘连蛋白B1-KO(n个=29），层粘连蛋白B1-还原(n个=25）和层粘连蛋白B1（1-433）-救援(n个=30）个单元格。平均值±标准偏差*P（P）< 0.05, *P（P）<0.01，未配对t吨测试。3个独立实验。（E） 追踪2号染色体上的3个基因组位点并将其分配到核外周或核质室，包括1 Mb位点(n个=27），114 Mb基因座(n个=30）和236 Mb基因座(n个= 19). 计算两个区室中这些基因座的平均MSD曲线，并显示为平均值±SE。3个独立实验
图6
图6
染色质的全面分解有助于增加染色质动力学和染色体区域的混合。（A） DMSO处理的对照细胞和TSA处理的细胞中2号和18号染色体的代表性三维投影染色体绘制图像。绿色：2号染色体的FISH信号。红色：18号染色体的FISH信号。蓝色：DAPI染色。显示了核Z堆的最大强度投影。比例尺，5µm。（B） 染色体2和18相对于核体积所占体积的量化。平均值±标准偏差***P（P）<0.001，Mann-Whitney检验。3个独立实验。（C） 基于染色体质心到核质心的相对距离对染色体核定位进行量化。这个距离用核体积的立方根来归一化。Mann–Whitney测试。3个独立实验。（D） 2号染色体和18号染色体区域之间重叠频率的量化。对照细胞中呈现2号染色体和18号染色体区域相互作用的细胞比率(n个=106）明显小于TSA处理的细胞（n=132）***P（P）<0.001，Fisher精确检验。3个独立实验。（E） DMSO处理的对照细胞2号染色体上1Mb基因座的MSD曲线(n个=25）和TSA处理的细胞(n个= 26). 平均值±SE.3独立实验。（F） DMSO处理的对照细胞2号染色体上1Mb基因座的空间定位(n个=96）和TSA处理的细胞(n个= 81). 费希尔精确测试。3个独立实验。（G） 2号染色体、18号染色体和19号染色体的示意图和PC1值图。橙色代表A区，蓝色代表B区。箭头表示所选基因座的基因组分布。（H） 平均MSD曲线和（I）2号染色体、18号染色体和19号染色体上10个基因组位点的扩散系数分布。红色表示属于A区的位点，蓝色表示属于B区的位点。3个独立实验
图7
图7
内部和外周核基质蛋白对3D染色质结构的拖拽调节模型。描述层粘连蛋白B1将染色质栓系到核外周，并与核基质作用拖船，将染色质拉向核内，以协调适当染色质高阶结构和动力学的建立和维持。椎板层粘连蛋白B1的缺失会从核外周向核内释放一部分LAD，导致核质中松散折叠的染色质增加。染色体紧密状态的改变导致染色体区域的扩大，从而增加了不同染色体之间的相互作用比率。此外，失去对特定LAD的抓取会降低染色质分区的完整性和隔离性，并且部分基因组区域会在A和B分区之间切换。此外，层粘连蛋白B1的缺失可以增加基因组位点的动态。同一基因座在不同亚核区的动态运动表现出显著差异，核周边定位基因座的活动性远低于核质定位基因座。此外，染色质压实是影响染色质动力学的一个更基本的因素。不太紧凑的A区的基因组位点比更紧凑的B区具有更高的流动性
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