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.2020年9月；25(8):939-949.
doi:10.1177/2472555220915821。 Epub 2020年4月30日。

开发和优化高含量分析平台以识别Lamin B1过度表达抑制因子作为常染色体显性白细胞营养不良的治疗策略

布鲁斯·恩梅齐 1, 劳拉·沃尔默 2, 童英顺 2, 阿尔伯特·高夫 2 三, Harshvardhan Rolyan公司 1 4, 刘芳（音） 1, 贾玉萌 1, 类星体S Padiath 1, 安德烈亚斯·沃格特 2 三
附属公司

开发和优化高含量分析平台以识别Lamin B1过度表达抑制因子作为常染色体显性白细胞营养不良的治疗策略

布鲁斯·恩梅齐等。 SLAS发现. 2020年9月.

摘要

常染色体显性白质营养不良（ADLD）是一种以广泛的中枢神经系统（CNS）脱髓鞘和严重的发病率为特征的致死性、进行性成人疾病。发病年龄晚，疾病进展相对缓慢，为该疾病提供了一个很大的治疗窗口。然而，ADLD没有治疗方法，这是一种迫切而尚未满足的临床需求。我们之前已经证明，ADLD是由层粘连蛋白B1基因的重复引起的，导致层粘连蛋白质B1的表达增加，层粘连基因B1是核层粘连的主要组成部分，并证明，具有少突胶质细胞特异性过表达层粘连蛋白B1的转基因小鼠表现出与人类疾病相似的时间和组织病理学特征。由于层粘连蛋白B1水平的增加是引发ADLD的病因性事件，旨在降低层粘连蛋白质B1水平和相关功能后果的方法是发现小分子ADLD治疗药物的一个有希望的策略。为此，我们建立了层粘连蛋白B1过度表达的诱导细胞培养模型，并开发了与多元分析相关的高含量分析，以定义、分析和量化小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中层粘连蛋白质B1的表达及其相关的异常核表型。该测定法已进行优化，以满足多日变异性研究中的高通量筛选（HTS）标准。为了控制主要MEF中的批间变化，我们实施了一种筛选策略，使用哨兵单元来避免HTS期间的昂贵损失。我们认为该检测将确定真正的层粘连B1病理生理学抑制因子，作为ADLD潜在治疗的候选药物。

关键词：常染色体显性白质营养不良；高含量分析；高通量筛选；层粘连蛋白B1；多元分析。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1.诱导层粘连蛋白B1表达的小鼠模型的生成。
答：。生成TRE-FLAG-LMNB1的配对策略；Rosa rtTA胚胎成纤维细胞。在E13.5时从胚胎中分离出MEF，进行基因分型，并通过Western blot验证层粘连蛋白B1的表达。B。用多西环素（DOX）处理的MEF过度表达外源性FLAG-LMNB1的Western blot。FLAG的存在导致外源性层粘连蛋白B1的迁移速度略慢于内源性层粘着蛋白B1，导致双带。C。B。蛋白印迹的定量。D。用抗层粘连蛋白B1抗体对MEF细胞核进行免疫荧光染色，发现由于层粘连酶B1过度表达，核包膜出现异常褶皱。E。去除DOX后，核异常是可逆的。Y轴显示了材料和方法中所述的通过目视检查和人工分类量化的异常细胞核百分比。误差线–95%置信区间，*-p<0.05。
图2。
图2.通过高含量分析对层粘连蛋白B1表达和核形态进行初步定量。
WT和TRE-LMNB1 MEF在96孔板中培养三天，在DOX存在或不存在的情况下，用抗层粘连B1/层粘连A/C抗体进行免疫染色。在ArrayScan II HCS阅读器上对平板进行扫描，并通过材料和方法中描述的靶激活生物应用程序分析层粘连蛋白表达和核纹理。每个方框图显示重复至少三次的单个实验的平均值、第一和第三四分位数以及四个井的范围。
图3。
图3：层粘连蛋白B1过度表达的影响取决于细胞密度。
在DOX刺激3天后，以不同密度播种WT或TRE-LMNB1 MEF，并用HCA进行分析。大多数参数都受到细胞密度的强烈影响，但由于WT和层粘连B1之间的一些差异，MEF的过度表达被保留下来。每个方框图显示重复两次的单个实验的平均值、第一和第三四分位数以及7-14个技术重复的范围。绿色，WT；红色，TRE-LMNB1 MEF。
图4。
图4.利用多个特征来充分捕捉层粘连蛋白B1过度表达和相关核异常的复杂性和异质性。
中的图像答：。显示了两个随机选择的来自野生型和转基因MEF的拉明B1染色细胞核区域，说明了核异常的异质性。在ImageXpress超共焦HCS阅读器上使用40倍物镜拍摄图像。B。直方图显示了细胞和井特征分布的差异，而这些差异不容易通过视觉检查来识别。绿色图为WT，红色图为TRE-LMNB1。每个图是来自30个孔的单个细胞的集合，每个孔至少包含1000个细胞。注意，为了清晰起见，只显示了参数的子集；全套参数见补充表1。C。对24个细胞和微孔特征以及三个异质性指数进行线性判别分析，将来自多个特征的信息整合到单个读数中，从而在两个数据集之间实现最大程度的分离，与单独表达层粘连蛋白B1相比，检测性能显著提高。请注意，LDA为这两个类返回相同的绝对值，因此无法建立S/B。
图5。
图5：用于确定批间响应性、分析性能和消除高温超导期间故障风险的哨兵电池设计。
A.HTS工作流程。从一小瓶原代细胞中，在解冻后留出一小部分，不刺激或用DOX刺激3天，以诱导层粘连B1的表达。大多数细胞被膨胀成多个烧瓶，并在第二次分裂后进行刺激实验。由于前哨细胞来自同一小瓶，并在大批次暴露于化合物之前进行处理，因此在执行大规模筛选之前识别出无反应批次，从而消除了高温超导期间丢失珍贵库化合物的风险。B.评估批次间的可变性。表显示了不同批次TRE-MEF在不同日期获得的标准HTS测量值。每个实验的数据都基于四个技术副本。
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